Органосохраняющие операции при раке почки, в частности, выполнение резекции опухолей сложных локализаций, требуют применения продолжительной тепловой ишемии с последующей реперфузией [1]. Ишемия/реперфузия является основной причиной развития острого повреждения почек (ОПП) [2]. Общее клиническое состояние данного подхода по-прежнему ассоциируется с высоким уровнем заболеваемости и смертности, несмотря на значительные успехи в поддерживающей терапии [3]. Важные открытия были сделаны в определении биологических последствий ишемического повреждения почек. Морфологический ответ клеток почечных канальцев зависит от интенсивности и тяжести ишемии и включает в себя потерю клеточной полярности, апоптоз, дедифференцировку жизнеспособных клеток, пролиферацию, дифференцировку и реституцию нормального эпителия [4]. Молекулярные механизмы, лежащие в основе каждого из этих явлений, интенсивно изучаются и имеют значительные перспективы для новых терапевтических подходов, направленных на повышение качества лечения и/или ускорения процесса восстановления.

В качестве возможного механизма, приводящего к гибели клеток почечных канальцев и эпителия после ишемического воздействия на почки, рассматривается апоптоз [5]. Апоптоз, характеризующийся сморщиванием клеток, конденсацией и фрагментацией ядер и межнуклеосомной деградацией ДНК, был зарегистрирован в культивируемых клетках почечных канальцев в образцах биоптатов человека, полученных из почек трупов [6]. Поэтому в настоящее время интерес исследователей направлен на идентификацию внутриклеточных путей, участвующих в рецепции стимулов, передаче сигналов и реализации фаз апоптоза клетками трубчатого эпителия почек в результате воздействия ишемии/реперфузии.

По данным ряда авторов, даже при использовании тепловой ишемии стандартной продолжительности (до 20 мин включительно) в раннем послеоперационном периоде возникают осложнения в виде развития острого повреждения почек (ОПП) в 20-30% случаев [6-9]. Ишемия тканей сопровождается повреждением субклеточных структур, в том числе митохондрий, что приводит к активации факторов апоптоза и инициации каспаз-зависимого апоптозного каскада, в результате которого клетки «совершают самоубийство» [10].

До настоящего времени влияние тепловой ишемии и последующей реперфузии на транскрипционный профиль апоптоз-регулирующих генов в почечной ткани пациентов, больных раком, описано недостаточно [11]. Поэтому целью нашего исследования стало изучение изменения экспрессии апоптоз-регулирующих генов MDM 2, BAX, CASP7, CASP3, CASP8, CASP9, BCL2, CASP8/ FADD (CFLAR), p53, APAF1, AIFM1, ICAD, XIAP в почечной ткани больных с почечно-клеточным раком для расширения представлений о фундаментальных молекулярных механизмах повреждающего действия ишемии и реперфузии.

Для исследования использовали биоптаты тканей 12 пациентов популяции Юга России с гистологически подтвержденным диагнозом рак почки, поступивших на лечение в ФГБУ РНИОИ МЗ РФ в 2014-2015 гг. Исследование было одобрено этическим комитетом ФГБУ РНИОИ; в каждом конкретном случае было получено информированное согласие больного на включение его в данное исследование, в том числе, на биопсию почки.

Продолжительность тепловой ишемии почки в процессе проведения операции не превышала 20 мин. Во время проведения лапароскопической резекции почки с использованием тепловой ишемии, до остановки кровоснабжения в резецируемой почке с помощью пистолета Pro Mag Ultra иглой 16 G выполняли пункционную биопсию среднего сегмента резецируемой почки, забирая столбик ткани интактной паренхимы. Пункционную биопсию повторяли на 10-й минуте ишемии и через 20 мин после восстановления кровотока в почке. Гемостаз осуществляли при помощи электрокоагуляции, в случае необходимости накладывался гемо статический шов. Образцы для транспортировки в лабораторию и хранения мгновенно замораживали в жидком азоте без использования крио-/транспортных РНК-сред. Максимальное время от взятия образца до его заморозки в жидком азоте составляло не более 20 с.

Фрагменты ткани измельчали и растирали в фарфоровых ступках в лизирующем растворе, содержащем 4 М гуанидин тиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,5% саркозил и 0,1 М 2-меркаптоэтанол. Дальнейшее выделение РНК из тканей проводили по методу P. Chomczynski и N. Sacchi [12]. Полученные образцы суммарной РНК обрабатывали препаратами ДНК-азы. Синтез кДНК проводили с использованием коммерческих наборов «Reverta-L» («Интерлабсервис», Россия).

Методом RT-qPCR определяли величины относительной экспрессии 13 генетических локусов: MDM2, BAX, CASP7, CASP3, CASP8, CASP9, BCL2, CASP8/FADD (CFLAR), p53, APAFI, AIFMI, ICAD, XIAP. В качестве референсного использовали ген ACTB. Дизайн специфичных олигону- клеотидных праймеров (таблица) осуществлялся нами с использованием референсных последовательностей NCBI GenBank и программы Primer- BLAST на основе следующих принципов: область отжига олигонуклеотидных праймеров должна быть в диапазоне 58-63 °С; GC-состав в диапазоне 40-60%; в последовательности праймера должны отсутствовать стабильные вторичные структуры - шпильки и димеры, e-value последовательности праймера должно стремится к нулю и быть не больше 0,05, а query coverage (покрытие целевой последовательности) 100% (для версии BLASTN 2.3.1+), температуры отжига праймеров (forward и reverse) не должны различаться друг от друга более чем на 0,50. При подборе праймеров учитывался сплайсинг мРНК (использовали опцию «Primer must span an exon-exon junction» программы Primer-BLAST): так для гена ACTB прямой праймер покрывает соответствующую последовательность в конце 3-го экзона, а обратный праймер - последовательность в начале 4-го экзона.

Анализируемые последовательности генетических локусов амплифицировали в 25 мкл ПЦР-смеси, содержащей 12 нг кДНК, 0,25мМ dNTPs, 2,5 мМ MgCl2, 1х-ый ПЦР-буфер и 1 ед. акт. SynTaq ДНК-полимеразы с ингибирующими активность фермента антителами («Синтол», Россия), краситель EVA-Green и по 400 нМ прямого и обратного праймеров для референсного гена (β-актина, ACTB) или гена-мишени. Количественную ПЦР-РВ-амплификацию проводили на термоциклере «Bio-Rad CFX96» («Bio-Rad», USA) по следующей программе: первичная денатурация: t=95 0C в течение 3 мин 40 циклов: t=95 0C в течение 10 с, t=58 0C в течение 30 с, t=72 0C в течение 30 с. Относительную экспрессию генетического локуса (RE) рассчитывали по формуле RE =2_ΔΔα [13, 14]. Нормализацию проводили по референс- ному гену ACTB и экспрессии генов в образцах пункционной биопсии, отобранных у этих же пациентов до остановки кровоснабжения, последовательно по схеме, приведенной ниже:

ДДC(t) = ДC(t)Медиана опытной группы – ДC(t) Медиана контрольной группы.

Статистический анализ результатов выполняли с использованием пакета прикладных статистических программ «Microsoft Excel 2013» («Microsoft Corporation», США) и STATISTICA 8.0 (StatSoft Inc., США). Результаты представлены в виде среднего арифметического ± ошибка средней. Статистическую значимость различий двух средних определяли с помощью непараметрического критерия Вилкоксона для связных выборок; частот - х2-критерия Пирсона. Нулевую статистическую гипотезу об отсутствии различий и связей отвергали при p<0,05.

На 10-й минуте проведения тепловой ишемии транскриптомный профиль исследованных нами генов MDM2, BAX, CASP3, CASP8, CASP9, BCL2, CASP8/FADD (CFLAR), p53, APAF1, AIFM1 и XIAP достоверно не отличался от аналогичных показателей экспрессии этих же генетических локусов до проведения ишемии (контроль), и только экспрессия генов CASP7 и ICAD статистически достоверно (p<0,05) снижалась на 40 и 10% соответственно по отношению к показателям контроля (рис. 1).

Через 20 мин после восстановления кровотока (реперфузии) наблюдалось статистически достоверное (p<0,05) увеличение экспрессии генов в тканях почки по сравнению с состоянием до проведения тепловой ишемии (рис. 2) как проапоптоз- ных генов - BAXна 30%, CASP3 и 7 на 30%, p53 на 60% и APAF1 на 50%, так и антиапоптозных генов XIAP на 30%, MDM2 на 30% и BCL2 на 40%.

Через 20 мин после реперфузии почки относительно состояния на 10-й минуте ишемии наблюдалось статистически достоверное (p<0,05) увеличение экспрессии следующих генов MDM2, CASP7, CASP3, CASP8, CASP9, BCL2, p53, APAF1, AIFM1, ICAD и XIAP на 40, 110, 80, 40, 150, 80, 60, 80, 200, 20% и 50% соответственно (рис. 3).

При оценке соотношения экспрессии пар про- и антиапоптозных генов p53/MDM2 и BAX/BCL2 на 10-й минуте ишемии и через 20 мин после восстановления кровотока (рис. 4) обнаружены изменения в балансе экспрессии этих генов. На 10-й минуте тепловой ишемии почки соотношение p53/MDM2 на 8% (p<0,05) выше, чем до ишемии, что связано со снижением экспрессии MDM2 в этой временной точке относительно состояния до ишемии на 8%; а соотношение BAX/BCL2 на 10% (p<0,05) выше, чем до ишемии, что связано с изменением экспрессии обоих генов. На стадии реперфузии соотношение p53/MDM2 на 25% (p<0,05) выше, чем до ишемии, что обусловлено более значительным увеличением экспрессии гена p53, чем MDM2; а соотношение экспрессии генов BAX/BCL2 на 10% (p<0,05) ниже, чем до ишемии, что обусловлено более значительным увеличением экспрессии гена BCL2, чем гена BAX.

Отсутствие статистически достоверных изменений экспрессии большинства как про-, так и антиапоптозных кластеров генов во время проведения тепловой ишемии почки свидетельствует о том, что прекращение снабжения почки на 10 мин не создает необходимых условий для изменения транскрипционной активности исследованных генов, вовлеченных в регуляцию механизмов внутреннего и/или внешнего рецепторного путей апоптоза. Также нами не исключается возможность того, что для реализации каких-либо изменений необходим более длительный интервал времени (латентный период). Статистически значимое снижение экспрессии в данном временном диапазоне было отмечено для одной из эффекторных каспаз - каспазы-7, что можно охарактеризовать как ингибирование апоптоза, а также для антиапоптозного гена ICAD, участвующего в предотвращении фрагментации ДНК и конденсации хроматина.

Через 20 мин после восстановления кровотока (реперфузии), по сравнению с состоянием до проведения ишемии, наблюдается множественная активация транскрипции исследованных генетических локусов (см. рис. 2). Статистически значимо через 20 мин после реперфузии почки наблюдалась активация транскрипции генов, продукты которых вовлечены в регуляцию р53-зависимого пути апоптоза (MDM2 и р53), митохондриального пути апоптоза (продукт гена BAX образует олигомерные поры в митохондриальной мембране, что приводит к высвобождению цитохрома С, продукт гена APAF1, связываясь с цитохромом С и dATP, формирует апаптосому) и эффекторную часть каспазного каскада (гены эффекторной каспазы-3 и -7, CASP3 и 7). Также наблюдалось статистически достоверное увеличение экспрессии на 30% гена XIAP, основной функцией которого является ингибирование процесса апоптоза в клетках [15]. XIAP связывает и ингибирует каспазы-3, -7 и -9, таким образом, блокируя как внешний (рецепторный), так и внутренний (митохондриальный) пути апоп- тоза [16].

Пермеабилизация митохондриальной мембраны регулируется белками семейства BCL2 [17]. Встраивание в мембрану митохондрий белков BAX приводит к образованию пороподобных структур, а активация и функционирование BAX может блокироваться антиапоптотическим белком BCL-2 [18]. В нашем эксперименте через 20 мин после реперфузии почки в её тканях обнаружено статистически достоверное увеличение экспрессии гена BCL2 (превышающее увеличение экспрессии гена BAX), результатом чего может быть ингибирование митохондриального пути апоптоза.

p53 относится к генам-онкосупрессорам, но одной из важных функций продукта этого гена (белка p53) является активация белков репарации ДНК при её повреждении [19]. Существенное и статистически достоверное увеличение экспрессии этого белка в почечной ткани на этапе реперфузии может свидетельствовать об усилении процессов образования АФК и повреждении ДНК. С другой стороны - увеличение в почечной ткани пациентов экспрессии гена р53 может стимулировать экспрессию гена MDM2 [20]. Продукт гена MDM2 в свою очередь блокирует действие р53, связываясь с ним, убиквитинилирует его для последующей деградации протеасомой. Всё это в совокупности с активаций экспрессии гена XIAP и BCL2, вероятно, препятствует развитию апоптических процессов в данном временном интервале.

При сравнении транскриптомных характеристик исследуемых генов на 10-й минуте ишемии и через 20 мин после реперфузии наблюдаются более значительные отличия, чем при сравнении с состоянием до ишемии. Достоверно увеличивается экспрессия всех генов, за исключением BAX и CFLAR. Следует отметить значительное повышение экспрессии генов CASP8, CASP9 и AIFMI (см. рис. 3) и их важную роль в развитии апоптоза. Каспаза-8 - классическая инициирующая каспаза, участвующая в передаче сигнала от рецепторов апоптоза Fas, TNF-R1 и DR1-5 связывается с белком FADD и инициирует протеолитический каскад [21]. Каспаза-9 активирует каспазу-3, которая в свою очередь расщепляет прокаспазу-9, таким образом создается цикл амплификации апоптозного сигнала, при этом активация каспазы-9 сопровождается высвобождением модуля CARD, повышающего экспрессию антиапоптозных генов [22]. В результате индукции апоптоза белок AIFM1 перемещается в ядро, где он вызывает конденсацию и фрагментацию хромосом; кроме того, он индуцирует высвобождение митохондриями апоптогенного фактора цитохрома С [23].

При анализе соотношения экспрессии генов p53/MDM2 и BAX/BCL2 (см. рис. 4) необходимо учитывать тот факт, что экспрессия генов MDM2 и BCL2 значительно превышает экспрессию генов p53 и BAX на 48 и 71% (при сравнении относительно гена ACTB) соответственно. Однако обнаруженные изменения соотношений экспрессии отражают состояние баланса про/антиапоптозных систем в клетках почек, подвергнутых ишемии/ реперфузии. При этом наибольшее отклонение от состояния до ишемии характерно для системы p53/MDM2 через 20 мин после реперфузии. Это может объясняться накоплением повреждений в ДНК активными формами кислорода на стадии реперфузии, что вызывает повышение экспрессии гена p53 для активации репарационных процессов. Соотношение экспрессии генов BAX/BCL2 относительно состояния до ишемии изменяется менее значительно, наибольшее отличие в балансе BAX/BCL2 наблюдается между 10-й минутой ишемии и через 20 мин после реперфузии.

В рамках проведенного нами исследования установлено, что ишемия и реперфузия оказывают разноплановый характер воздействия на уровень относительной экспрессии апоптозрегулирующих генетических локусов. В обоих случаях (ишемия и реперфузия) наблюдается почти синхронное угнетение (при ишемии) или активация (реперфузия) транскрипционной активности про-апоптозных и антиапоптозных генов. Это состояние сохраняющегося паттерна транскрипционной активности при различной модальности её направленности, вероятно, является характерным для состояния почечной ткани в ранний период после ишемии и восстановления в ней кровотока. Вероятность развития апоптоза по «митохондриальному пути» и по p53-индуцированному сигнальному пути является максимальным на 20-й минуте реперфузии. Какой именно из этих механизмов реализуется, будет зависеть от индивидуальных паттернов транскрипционной активности исследованных генов у каждого пациента.