Денис Сергеевич Кутилин, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник.
Лаборатория молекулярной онкологии
344037, г. Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, д. 63.
Сергей Николаевич Димитриади, старший научный сотрудник, врач-уролог, доктор медицинских наук
Отделение онкоурологии
344037, г. Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, д. 63.
Дмитрий Игоревич Водолажский, кандидат биологических наук.
Лаборатория молекулярной онкологии, руководитель
344037, г. Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, д. 63.
Елена Михайловна Франциянц, доктор биологических наук.
Лаборатория изучения патогенеза злокачественных опухолей, руководитель
344037, г. Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, д. 63.
Профессор Олег Иванович Кит, доктор медицинских наук, директор.
344037, г. Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, д. 63.
Расширение представлений о молекулярных механизмах повреждающего действия тепловой ишемии с реперфузией на почечную ткань больных раком почки имеет значительные перспективы для новых терапевтических подходов, направленных на повышение качества лечения. ЦЕЛЬ: изучение изменения экспрессии апоптоз-регулирующих генов MDM 2, BAX, CASP7, CASP3, CASP8, CASP9, BCL2, CASP8/FADD, p53, APAF1, AIFM1, ICAD и XIAP в почечной ткани больных с почечно-клеточным раком, подвергнутой действию ишемии и реперфузии. ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ. Для исследования использовали биоптаты тканей 12 пациентов с гистологически подтвержденным диагнозом рак почки. Пункционную биопсию проводили до остановки кровоснабжения, на 10-й минуте ишемии и через 20 мин после восстановления кровотока в почке. Относительную экспрессию генетических локусов определяли методом ПЦР в реальном времени. РЕЗУЛЬТАТЫ. Обнаружено: 1) отсутствие на 10-й минуте ишемии достоверных отличий транскриптомного профиля большинства исследованных нами генов от аналогичных показателей до проведения ишемии, за исключением снижения экспрессии гена CASP7 и ICAD; 2) достоверное увеличение экспрессии как про-апоптозных генов (BAX, CASP3 и 7, p53 и APAF1), так и антиапоптозных генов (XIAP, MDM2 и BCL2) через 20 мин после восстановления кровотока в тканях почки; 3) изменение в балансе экспрессии пар прои антиапоптозных генов p53/MDM2 и Bax/ BCL2 на 10-й минуте ишемии и через 20 мин после восстановления кровотока. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Полученные данные характеризуют транскриптомное состояния почечной ткани в ранний период после ишемии и восстановления в ней кровотока как инициаторную точку сдвига баланса прои антиапоптозных генов.
Improved knowledge of molecular mechanisms of the damaging effect of thermal ischemia and reperfusion to renal tissue of patients with renal cancer has significant prospects for new therapeutic approaches aimed at enhancing quality of care. THE AIM: to study changes in the expression of apoptosis-regulating genes MDM 2, BAX, CASP7, CASP3, CASP8, CASP9, BCL2, CASP8 / FADD, p53, APAF1, AIFM1, ICAD and XIAP in renal tissue of patients with renal cell carcinoma subjected to the action of ischemia and reperfusion. PATIENTS AND METHODS. We used for the study tissue biopsies of 12 patients with histologically confirmed diagnosis of renal cancer. Needle biopsy was performed before stop the blood supply, for 10 minutes of ischemia and 20 minutes after reperfusion in the kidney. The relative expression of genetic loci was determined by real-time PCR. RESULTS. It was found: 1) absence from the 10th minute of ischemia significant differences transcriptome profile of the majority of investigated genes from similar parameters prior to ischemia, with the exception of reducing expression of genes CASP7 and ICAD; 2) a significant increase in expression of pro-apoptotic genes (BAX, CASP3/7, APAF1 and p53), and anti-apoptotic genes (XIAP, MDM2 and BCL2) 20 minutes after reperfusion of the kidney tissue; 3) a changes in the balance of expression of pairs of proand anti-apoptotic genes p53 / MDM2 and Bax / BCL2 in the 10th minute of ischemia and 20 minutes after reperfusion. CONCLUSION. These data characterize transcriptomic state of renal tissue in the early period after ischemia and restore the blood flow in it as the initiation point shift the balance of proand anti-apoptotic genes.
Органосохраняющие операции при раке почки, в частности, выполнение резекции опухолей сложных локализаций, требуют применения продолжительной тепловой ишемии с последующей реперфузией [
В качестве возможного механизма, приводящего к гибели клеток почечных канальцев и эпителия после ишемического воздействия на почки, рассматривается апоптоз [
По данным ряда авторов, даже при использовании тепловой ишемии стандартной продолжительности (до 20 мин включительно) в раннем послеоперационном периоде возникают осложнения в виде развития острого повреждения почек (ОПП) в 20-30% случаев [6-9]. Ишемия тканей сопровождается повреждением субклеточных структур, в том числе митохондрий, что приводит к активации факторов апоптоза и инициации каспаз-зависимого апоптозного каскада, в результате которого клетки «совершают самоубийство» [
До настоящего времени влияние тепловой ишемии и последующей реперфузии на транскрипционный профиль апоптоз-регулирующих генов в почечной ткани пациентов, больных раком, описано недостаточно [
Для исследования использовали биоптаты тканей 12 пациентов популяции Юга России с гистологически подтвержденным диагнозом рак почки, поступивших на лечение в ФГБУ РНИОИ МЗ РФ в 2014-2015 гг. Исследование было одобрено этическим комитетом ФГБУ РНИОИ; в каждом конкретном случае было получено информированное согласие больного на включение его в данное исследование, в том числе, на биопсию почки.
Продолжительность тепловой ишемии почки в процессе проведения операции не превышала 20 мин. Во время проведения лапароскопической резекции почки с использованием тепловой ишемии, до остановки кровоснабжения в резецируемой почке с помощью пистолета Pro Mag Ultra иглой 16 G выполняли пункционную биопсию среднего сегмента резецируемой почки, забирая столбик ткани интактной паренхимы. Пункционную биопсию повторяли на 10-й минуте ишемии и через 20 мин после восстановления кровотока в почке. Гемостаз осуществляли при помощи электрокоагуляции, в случае необходимости накладывался гемо статический шов. Образцы для транспортировки в лабораторию и хранения мгновенно замораживали в жидком азоте без использования крио-/транспортных РНК-сред. Максимальное время от взятия образца до его заморозки в жидком азоте составляло не более 20 с.
Фрагменты ткани измельчали и растирали в фарфоровых ступках в лизирующем растворе, содержащем 4 М гуанидин тиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,5% саркозил и 0,1 М 2-меркаптоэтанол. Дальнейшее выделение РНК из тканей проводили по методу P. Chomczynski и N. Sacchi [
Методом RT-qPCR определяли величины относительной экспрессии 13 генетических локусов: MDM2, BAX, CASP7, CASP3, CASP8, CASP9, BCL2, CASP8/FADD (CFLAR), p53, APAFI, AIFMI, ICAD, XIAP. В качестве референсного использовали ген ACTB. Дизайн специфичных олигону- клеотидных праймеров (таблица) осуществлялся нами с использованием референсных последовательностей NCBI GenBank и программы Primer- BLAST на основе следующих принципов: область отжига олигонуклеотидных праймеров должна быть в диапазоне 58-63 °С; GC-состав в диапазоне 40-60%; в последовательности праймера должны отсутствовать стабильные вторичные структуры - шпильки и димеры, e-value последовательности праймера должно стремится к нулю и быть не больше 0,05, а query coverage (покрытие целевой последовательности) 100% (для версии BLASTN 2.3.1+), температуры отжига праймеров (forward и reverse) не должны различаться друг от друга более чем на 0,50. При подборе праймеров учитывался сплайсинг мРНК (использовали опцию «Primer must span an exon-exon junction» программы Primer-BLAST): так для гена ACTB прямой праймер покрывает соответствующую последовательность в конце 3-го экзона, а обратный праймер - последовательность в начале 4-го экзона.
Таблица
Характеристика используемых в исследовании праймеров
Наименование праймеров | № NCBI GenBank | Последовательность | T отжига, 0C |
---|---|---|---|
ACTB (reference) | NM_001101.3 | Прямой: AAC CGC GAG AAG ATG ACC CОбратный: AGC ACA GCC TGG ATA GCA AC | 6060 |
MDM2 | NM_001145339.2 | Прямой: TAG GAG All TGT IIG GCG TGCОбратный: CCT GCT GAT TGA CTA CTA CCA A | 6060 |
BAX | NM_001291428.1 | Прямой: GGG ACG AAC TGG ACA GTA ACAОбратный: GCT GCC ACT CGG AAA AAG AC | 6160 |
BCL2 | NM_000633.2 | Прямой: GGA TCC AGG ATA ACG GAG GCОбратный: GAA ATC AAA CAG AGG CCG CA | 6358 |
р53 | NM_000546.5 | Прямой: MG GAA CTC AAG GAT GCC CAОбратный: CGG GAG GTA GAC TGA CCC T | 5862 |
CASP3 | NM_004346.3 | Прямой: CTG GAA TAT CCC TGG ACA ACA GTОбратный: TCG ACA TCT GTA CCA GAC CGA | 6361 |
CASP8 | NM_001228.4 | Прямой: CTG AAG CAA ACA GCC AGT GCОбратный: GAC CTC AAT TCT GAT CTG CTC AC | 6063 |
CASP9 | NM_032996.3 | Прямой: TGA GAC CCT GGA CGA CAT CTОбратный: TCC CTT TCA CCG AAA CAG CA | 6058 |
CASP7 | NM_033338.5 | Прямой: AAG CTG ACT TCC TCT TCG CCОбратный: TCC AGG TCT TTT CCG TGC TC | 6060 |
CFLAR | NM_003879.5 | Прямой: GCC GAG GCA AGA TAA GCA AGОбратный: AAT CCA GTT GAT CTG GGG CAA | 6060 |
AIFM1 | NM_001130847.3 | Прямой: TCA GGG ACA AAG TGG TCG TGОбратный: ATC TTC ATG CTG CTC ACC GT | 6058 |
APAF1 | NM_001160.2 | Прямой: ACC TCT GCT GAC AAG ACT GCОбратный: GTT GTG GCC CCT CAA TTC AT | 6058 |
XIAP | NM_001167.3 | Прямой: ACT GAG AAA ACA CCA TCA CTA ACTОбратный: TGT CCT TGA AAC TGA ACC CCA | 6060 |
ICAD | NM_213566.1 | Прямой: TCT GTC CAG CAT CAT CCT CCОбратный: GGT GGC ACA ACT CTG ACG TA | 6060 |
Анализируемые последовательности генетических локусов амплифицировали в 25 мкл ПЦР-смеси, содержащей 12 нг кДНК, 0,25мМ dNTPs, 2,5 мМ MgCl2, 1х-ый ПЦР-буфер и 1 ед. акт. SynTaq ДНК-полимеразы с ингибирующими активность фермента антителами («Синтол», Россия), краситель EVA-Green и по 400 нМ прямого и обратного праймеров для референсного гена (β-актина, ACTB) или гена-мишени. Количественную ПЦР-РВ-амплификацию проводили на термоциклере «Bio-Rad CFX96» («Bio-Rad», USA) по следующей программе: первичная денатурация: t=95 0C в течение 3 мин 40 циклов: t=95 0C в течение 10 с, t=58 0C в течение 30 с, t=72 0C в течение 30 с. Относительную экспрессию генетического локуса (RE) рассчитывали по формуле RE =2_ΔΔα [13, 14]. Нормализацию проводили по референс- ному гену ACTB и экспрессии генов в образцах пункционной биопсии, отобранных у этих же пациентов до остановки кровоснабжения, последовательно по схеме, приведенной ниже:
ДДC(t) = ДC(t)Медиана опытной группы – ДC(t) Медиана контрольной группы.
Статистический анализ результатов выполняли с использованием пакета прикладных статистических программ «Microsoft Excel 2013» («Microsoft Corporation», США) и STATISTICA 8.0 (StatSoft Inc., США). Результаты представлены в виде среднего арифметического ± ошибка средней. Статистическую значимость различий двух средних определяли с помощью непараметрического критерия Вилкоксона для связных выборок; частот - х2-критерия Пирсона. Нулевую статистическую гипотезу об отсутствии различий и связей отвергали при p<0,05.
На 10-й минуте проведения тепловой ишемии транскриптомный профиль исследованных нами генов MDM2, BAX, CASP3, CASP8, CASP9, BCL2, CASP8/FADD (CFLAR), p53, APAF1, AIFM1 и XIAP достоверно не отличался от аналогичных показателей экспрессии этих же генетических локусов до проведения ишемии (контроль), и только экспрессия генов CASP7 и ICAD статистически достоверно (p<0,05) снижалась на 40 и 10% соответственно по отношению к показателям контроля (рис. 1).
Через 20 мин после восстановления кровотока (реперфузии) наблюдалось статистически достоверное (p<0,05) увеличение экспрессии генов в тканях почки по сравнению с состоянием до проведения тепловой ишемии (рис. 2) как проапоптоз- ных генов - BAXна 30%, CASP3 и 7 на 30%, p53 на 60% и APAF1 на 50%, так и антиапоптозных генов XIAP на 30%, MDM2 на 30% и BCL2 на 40%.
Через 20 мин после реперфузии почки относительно состояния на 10-й минуте ишемии наблюдалось статистически достоверное (p<0,05) увеличение экспрессии следующих генов MDM2, CASP7, CASP3, CASP8, CASP9, BCL2, p53, APAF1, AIFM1, ICAD и XIAP на 40, 110, 80, 40, 150, 80, 60, 80, 200, 20% и 50% соответственно (рис. 3).
При оценке соотношения экспрессии пар про- и антиапоптозных генов p53/MDM2 и BAX/BCL2 на 10-й минуте ишемии и через 20 мин после восстановления кровотока (рис. 4) обнаружены изменения в балансе экспрессии этих генов. На 10-й минуте тепловой ишемии почки соотношение p53/MDM2 на 8% (p<0,05) выше, чем до ишемии, что связано со снижением экспрессии MDM2 в этой временной точке относительно состояния до ишемии на 8%; а соотношение BAX/BCL2 на 10% (p<0,05) выше, чем до ишемии, что связано с изменением экспрессии обоих генов. На стадии реперфузии соотношение p53/MDM2 на 25% (p<0,05) выше, чем до ишемии, что обусловлено более значительным увеличением экспрессии гена p53, чем MDM2; а соотношение экспрессии генов BAX/BCL2 на 10% (p<0,05) ниже, чем до ишемии, что обусловлено более значительным увеличением экспрессии гена BCL2, чем гена BAX.
Рис. 1. Изменение экспрессии генов на 10-й минуте ишемии почки относительно состояния до ишемии. *Отмечены локусы, изменения в которых были статистически достоверны для p<0,05.
Рис. 2. Изменение относительной экспрессии генов через 20 мин после реперфузии почки относительно состояния до ишемии. *Отмечены локусы, изменения в которых были статистически достоверны для p< 0,05.
Рис. 3. Изменение относительной экспрессии генов через 20 мин после реперфузии почки относительно состояния на 10 минуте ишемии. *Отмечены локусы, изменения в которых были статистически достоверны для p<0,05.
Рис. 4. Соотношение экспрессии пар про-/антиапоптозных генов p53/MDM2 и BAX/BCL2 до ишемии, на 10-й минуте ишемии и через 20 мин после восстановления кровотока в почке.
Отсутствие статистически достоверных изменений экспрессии большинства как про-, так и антиапоптозных кластеров генов во время проведения тепловой ишемии почки свидетельствует о том, что прекращение снабжения почки на 10 мин не создает необходимых условий для изменения транскрипционной активности исследованных генов, вовлеченных в регуляцию механизмов внутреннего и/или внешнего рецепторного путей апоптоза. Также нами не исключается возможность того, что для реализации каких-либо изменений необходим более длительный интервал времени (латентный период). Статистически значимое снижение экспрессии в данном временном диапазоне было отмечено для одной из эффекторных каспаз - каспазы-7, что можно охарактеризовать как ингибирование апоптоза, а также для антиапоптозного гена ICAD, участвующего в предотвращении фрагментации ДНК и конденсации хроматина.
Через 20 мин после восстановления кровотока (реперфузии), по сравнению с состоянием до проведения ишемии, наблюдается множественная активация транскрипции исследованных генетических локусов (см. рис. 2). Статистически значимо через 20 мин после реперфузии почки наблюдалась активация транскрипции генов, продукты которых вовлечены в регуляцию р53-зависимого пути апоптоза (MDM2 и р53), митохондриального пути апоптоза (продукт гена BAX образует олигомерные поры в митохондриальной мембране, что приводит к высвобождению цитохрома С, продукт гена APAF1, связываясь с цитохромом С и dATP, формирует апаптосому) и эффекторную часть каспазного каскада (гены эффекторной каспазы-3 и -7, CASP3 и 7). Также наблюдалось статистически достоверное увеличение экспрессии на 30% гена XIAP, основной функцией которого является ингибирование процесса апоптоза в клетках [
Пермеабилизация митохондриальной мембраны регулируется белками семейства BCL2 [
p53 относится к генам-онкосупрессорам, но одной из важных функций продукта этого гена (белка p53) является активация белков репарации ДНК при её повреждении [
При сравнении транскриптомных характеристик исследуемых генов на 10-й минуте ишемии и через 20 мин после реперфузии наблюдаются более значительные отличия, чем при сравнении с состоянием до ишемии. Достоверно увеличивается экспрессия всех генов, за исключением BAX и CFLAR. Следует отметить значительное повышение экспрессии генов CASP8, CASP9 и AIFMI (см. рис. 3) и их важную роль в развитии апоптоза. Каспаза-8 - классическая инициирующая каспаза, участвующая в передаче сигнала от рецепторов апоптоза Fas, TNF-R1 и DR1-5 связывается с белком FADD и инициирует протеолитический каскад [
При анализе соотношения экспрессии генов p53/MDM2 и BAX/BCL2 (см. рис. 4) необходимо учитывать тот факт, что экспрессия генов MDM2 и BCL2 значительно превышает экспрессию генов p53 и BAX на 48 и 71% (при сравнении относительно гена ACTB) соответственно. Однако обнаруженные изменения соотношений экспрессии отражают состояние баланса про/антиапоптозных систем в клетках почек, подвергнутых ишемии/ реперфузии. При этом наибольшее отклонение от состояния до ишемии характерно для системы p53/MDM2 через 20 мин после реперфузии. Это может объясняться накоплением повреждений в ДНК активными формами кислорода на стадии реперфузии, что вызывает повышение экспрессии гена p53 для активации репарационных процессов. Соотношение экспрессии генов BAX/BCL2 относительно состояния до ишемии изменяется менее значительно, наибольшее отличие в балансе BAX/BCL2 наблюдается между 10-й минутой ишемии и через 20 мин после реперфузии.
В рамках проведенного нами исследования установлено, что ишемия и реперфузия оказывают разноплановый характер воздействия на уровень относительной экспрессии апоптозрегулирующих генетических локусов. В обоих случаях (ишемия и реперфузия) наблюдается почти синхронное угнетение (при ишемии) или активация (реперфузия) транскрипционной активности про-апоптозных и антиапоптозных генов. Это состояние сохраняющегося паттерна транскрипционной активности при различной модальности её направленности, вероятно, является характерным для состояния почечной ткани в ранний период после ишемии и восстановления в ней кровотока. Вероятность развития апоптоза по «митохондриальному пути» и по p53-индуцированному сигнальному пути является максимальным на 20-й минуте реперфузии. Какой именно из этих механизмов реализуется, будет зависеть от индивидуальных паттернов транскрипционной активности исследованных генов у каждого пациента.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.