В соответствии с Banff 2013 [1] диагноз антительно-опосредованного отторжения (AMR, antibody-mediated rejection), одного из основных факторов потери аллографта почки (АП) [2, 3], может быть установлен только при выполнении морфологического исследования. В большинстве исследований частота выявления AMR низкая (4­10%) [2, 4, 5]. Однако эти данные могут не пол­ностью отражать истинную ситуацию по распро­страненности AMR, поскольку основаны на ре­зультатах индикационных биопсий. В подтверждение представлено несколько работ, в которых по данным протокольных биопсий АП частота выяв­ления отторжения значительно выше (18-40%) [6-9]. Целью исследования было определить ча­стоту выявления AMR при рутинном морфологи­ческом и иммунологическом мониторировании и его исходы у пациентов, получивших стандартную иммуносупрессивную терапию (ИСТ).

Исследуемая группа пациентов.

В исследование были включены 55 пациен­тов, которым была выполнена аллогенная транс­плантация почки в НИИ нефрологии ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова в 2007-2012 гг. Критерия­ми включения были: совместимость с донором по группе крови, отрицательный цитотоксический кросс-матч-тест и, как минимум, три биопсии АП. Основные клинико-демографические показа­тели исследуемой группы (n=55) представлены в табл. 1.

Морфологический и иммунологический мо­ниторинг.

В соответствии с программой морфологиче­ского мониторинга состояния АП всем пациен­там выполняли протокольные биопсии (3, 6, 12 мес после АТП и далее ежегодно). Показаниями к выполнению индикационных биопсий (в проме­жутки между протокольными) были: отсроченная функция АП, нарастание креатинина сыворотки крови ≥25% от предыдущего уровня, появление протеинурии ≥1 г/сут или ее нарастание на 50%, а также морфологический контроль проведен­ной терапии Т-клеточного и В-клеточного оттор­жения. Биопсии трансплантата выполняли под контролем сонографии в В-режиме с цветовым картированием и контролем биопсийного канала иглой для пункции 18G.

Морфологический анализ. Для светооптическо­го исследования 4 мкм серийные срезы биоптата окрашивали гематоксилином и эозином, реак­тивом Шиффа (PAS), трихромальной окраской. Выраженность морфологических изменений АП оценивали в соответствии с Banff 2013 [1]. Персистирующим гуморальное отторжение считали при наличии гломерулита и/или перитубулярного капиллярита (рис. 1) в следующей биопсии, выполненной в срок >5 нед после первой с при­знаками AMR. Иммунофлюоресцентное исследование С4d в перитубулярных капиллярах (C4d- ptc) выполняли на замороженных срезах с FITC- мечеными моноклональными антителами.

Иммунологический анализ. Количество несо­впадений по системе генов HLA (HLA mismatch) стандартно определяли при типировании донора и реципиента по локусам A, B, DR, а в 20% случа­ев (n=11) было выполнено типирование по локу­сам HLA C, -DQ, -DP. Предсуществующие анти­тела (ПРА) определяли иммуноферментным ана­лизом (ИФА). Скрининг ДСА выполняли ИФА, а последующий контроль при ДСА-позитивности, рутинный мониторинг, а также в случае выявле­ния морфологических признаков AMR при отри­цательном результате ИФА - с помощью мульти­плексного анализа Luminex (xMAP Technology). Реакцию на ДСА (Luminex) считали позитивной при средней интенсивности флюоресценции (MFI, mean fluorescence intensity) ≥ 500.

Иммуносупрессивная терапия и терапия отторжения.

Индукционная и базисная терапия у всех паци­ентов включала пульсовое введение глюкокорти­костероидов (ГКС), анти-CD25 моноклональное антитело (базиликсимаб), ингибиторы кальциневрина и микофенолата мофетил (ММФ). В связи с высоким уровнем сенсибилизации двум паци­ентам (ПРА 67 и 25%) перед АТП был выполнен плазмаобмен (ПО) и введен внутривенный имму­ноглобулин (ВВИГ). При первичном выявлении AMR проводили лечение ГКС (500-250-125 мг внутривенно с переходом на пероральный при­ем 0,5 мг/кг и снижением до поддерживающей дозы в течение 2 нед) в сочетании с ПО (с заме­щением 1-1,5 объема циркулирующей плазмы; № 3-6 с интервалом 2-3 дня) и введением ВВИГ в суммарной дозе 1 г/кг массы. Если пациент по­лучал циклоспорин А, выполняли конверсию на такролимус. При сохраняющихся признаках AMR по данным иммуноморфологического контроля продолжали терапию ПО и ВВИГ с присоедине­нием анти-CD20-агента (ритуксимаб) однократ­но в дозировке 375 мг/м2. В случае персистенции МВВ и ДСА выполняли повторное введение ритуксимаба и/или проводили курсы бортезомиба (1,3 мг/м2 2-кратно с интервалом 2 нед). При отсутствии признаков активности AMR при контрольной биопсии продолжали рутинный клинико-морфологический и иммунологический мониторинг.

Исходы и клинические показатели.

На момент биопсии с отторжением оценивали клинические признаки дисфункции АП: суточную протеинурию, креатинин и расчётную СКФскв EPI. Окончанием периода наблюдения считалась дата последнего морфологического исследования для пациентов без AMR и дата последнего клиниче­ского обследования для пациентов с AMR. Исхо­дом считали полную потерю функции АП и воз­врат на диализ.

Статистический анализ.

Для анализа различий между оцениваемыми параметрами в группах применялись критерий χ2, точный тест Фишера, t-критерий, критерий Манна-Уитни. Для анализа выживаемости был использован метод Каплана-Мейера. Статистиче­скую значимость различий между кривыми выжи­ваемости оценивали с помощью Log-rank-теста. При анализе выживаемости АП случаи потери трансплантата не по причине отторжения (n=3: рецидив фокально-сегментарного гломеруло- склероза, стеноз артерии трансплантата, апосте- матозный пиелонефрит) учитывали как цензури­рованные наблюдения. Достоверными различия считали при значениях p<0,05. Обработку данных производили с помощью пакетов программ при­кладного статистического анализа (XLSTAT 2016 for Windows для анализа кумулятивной частоты, Statistica 8.0 для анализа остальных данных). Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±SD) или средне­го значения и стандартной ошибки среднего (M±SEM) и в виде медианы и интерквартильного интервала [m (25-75%)].

Распространенность и структура антительно-опосредованного отторжения.

Медиана периода наблюдения от трансплан­тации до конца наблюдения составила 65 (47; 80) мес. Признаки AMR были выявлены в 13% от всех выполненных (индикационных и протокольных) биопсий (n=390). В результате диагноз AMR был установлен в те или иные сроки посттрансплантационного периода у 45% реципиентов (n=25). Ку­мулятивная частота AMR в исследуемой группе равномерно нарастала, достигнув 76% к 100 мес после АТП (рис. 2).

У 13 реципиентов АП имели место морфо­логические признаки острого AMR (aAMR), а у 12 - AMR впервые выявлено уже с признаками хронификации в виде развития гломерулопатии (ГП) (хроническое активное AMR; cAMR). По основным клинико-демографическим показате­лям предтрансплантационного периода пациенты с AMR не отличались от пациентов без гумораль­ного отторжения, как и группы aAMR и сAMR (табл. 2).

Микроваскулярное воспаление (МВВ), основ­ное морфологическое проявление AMR, в боль­шинстве случаев было представлено сочетанным поражением капилляров клубочка и интерстиция (см. рис. 1). Случаи изолированных гломерулита или перитубулярного капиллярита находили зна­чительно реже (табл. 3). Хроническое активное гуморальное отторжение закономерно регистри­ровали в более поздние сроки после АТП, чем острое AMR (55 (35;78) мес и 3 (1;14) мес, соот­ветственно, p<0,001). В группе cAMR выраженность интерстициального фиброза и тубулярной атрофии была закономерно выше. Среднее значе­ние балла Banff для ГП в группе cAMR составило 1,33±0,19. Отложения C4d-ptc достоверно чаще выявляли при aAMR, чем при cAMR (84 и 42%, p=0,013). По другим морфологическим и клини­ческим показателям, указанным в табл. 3, группы aAMR и cAMR достоверно не отличались.

Персистенцию МВВ в последующей биопсии регистрировали в 56% случаев AMR (табл.3). В группе aAMR в 77% случаев определяли хронификацию процесса, несмотря на проводимую те­рапию. Медиана периода от момента диагностики aAMR до выявления ГП при последующем мор­фологическом исследовании составила 13 (10; 22) мес. Кумулятивная частота выявления ГП в биоптатах АП представлена на рис. 3.

Предсуществующие ДСА регистрировали у 9 пациентов, а сформировавшиеся de novo - у 16. Из 9 случаев предсуществующих ДСА 4 были к анти-HLA-антителам I класса, 5 - к анти-HLA- антителам II класса. У 5 пациентов регистрировали de novo ДСА к I классу, у 8 - ко II классу (в том числе анти-HLA-DQ ДСА у трех пациентов), у 2 пациентов - к обоим классам анти-HLA-антител. У одного пациента были обнаружены de novo анти-MICA-антитела.

Терапия AMR в группах aAMR и сAMR досто­верно не отличалась, ритуксимаб получили 38% пациентов с aAMR и 33% с cAMR, а бортезомиб - 15 и 25% соответственно.

Выживаемость пациентов и аллографта почки.

9-летняя кумулятивная выживаемость пациен­тов составила 94,5% (рис. 4а), а выживаемость АП - 79 % (см. рис. 4б). 9-летняя выживаемость АП у пациентов с AMR была ожидаемо ниже 73% (см. рис. 4в). Различий в выживаемости АП в подгруп­пах aAMR и cAMR ((plog-rank=0,1), так же как и меж­ду подгруппами клинического/субклинического течения AMR (plog-rank=0,1), не выявили. Случаев потери АП у пациентов с C4d-ptc-негативным гу­моральным отторжением не было (plog-rank=0,038). Кумулятивная выживаемость АП при наличии ГП была достоверно ниже (plog-rank=0,018), чем при от­сутствии этого вида хронического повреждения, и за весь период наблюдения составила 72%.

Суждения о развитии той или иной степени иммунного конфликта лежат в основе представ­ления об аллогенной трансплантации, когда фор­мирование иммунных реакций возникает вслед­ствие выраженного полиморфизма системы HLA, определяющего несовпадения по ее локусам у по­давляющей пропорции реципиентов АП.

AMR является грозным осложнением посттрансплантационного периода, зачастую приводя к потери АП при сверхостром или остром течении. Эти риски на практике заложены в определение со­вместимости цитотоксическим кросс-матч-тестом, положительная реакция которого рассматривает­ся как стандартное противопоказание к АТП, по­скольку в отсутствие превентивных мер практиче­ски всегда сопровождается развитием острого или сверхострого течения отторжения по гуморально­му типу и потерей трансплантированного органа.

В течение длительного периода времени су­ществовало весьма спокойное отношение к раз­витию реакций отторжения, которое стимули­ровалось очевидным улучшением ближайших результатов (снижением частоты и клинической значимости отторжений в раннем посттрансплантационном периоде на фоне введения в широкую клиническую практику ингибиторов кальцинев- рина, ММФ и деплетирующих агентов) [10, 11].

Основу для такого подхода создает распро­страненная терминология, которая упрощает представления о сути иммунологического кон­фликта, сводя к общему термину «отторжение» без уточнения его механизмов, делая ведение «от­торжения», основанное на эмпирической клини­ческой диагностике и лечении, неоправданным и губительным для трансплантата.

Вместе с тем, очевидно существование по крайней мере 2 архетипов отторжения - опосре­дованного преимущественно Т- и В-лимфоцитами (клеточное и гуморальное соответственно). Более того, в пределах каждого могут быть выделены различные клинико-морфологические фенотипы, имеющие разное прогностическое значение [5, 12-14]. В клинической практике под отторжени­ем зачастую понимают ситуацию с клинически­ми проявлениями в виде развития дисфункции АП. Однако также очевидно, что за исключени­ем острых вариантов могут существовать и бо­лее медленно развивающиеся случаи иммунного конфликта, протекающие субклинически до тех пор, пока объем повреждения за счет клеточной инфильтрации, МВВ и фиброза не достигнет кри­тического [13].

В представляемом исследовании внимание было сфокусировано на клинических и субкли- нических вариантах AMR, возникающих у реци­пиентов АП с отрицательным цитотоксическим кросс-матч-тестом и низким уровнем предсуществующих анти-HLA-антител. Примененный под­ход представлял собой тщательный иммуноло­гический и морфологический мониторинг с кон­тролем анти-HLA-антител и выполнением про­токольных исследований АП, помимо биопсий со стандартными клиническими показаниями.

Во-первых, нами было установлена неожи­данно высокая частота развития AMR - почти у половины реципиентов АП выявлены признаки этого типа отторжения в те или иные сроки посттрансплантационного периода. Почти при каждом седьмом морфологическом исследовании АП, большинство из которых составили протокольные биопсии, выявляли признаки МВВ - типичного проявления AMR. Эти данные находятся в соот­ветствии с наблюдениями других, немногочис­ленных исследований, в которых для поиска AMR были использованы аналогичные подходы [9, 13, 15]. Напротив, в исследованиях с анализом мор­фологических данных на основе выполненных по клиническим показаниям биопсий АП частота AMR составляет от 3 до 18% [2, 5, 8] и, на наш взгляд, является существенно заниженной за счет выпадения субклинических случаев и случаев с минимальными клиническими проявлениями.

AMR - явно неоднородное состояние, а суть поиска стратегий эффективного ведения, сводится к необходимости стратификации, основанной на клинических, морфологических и молекулярно­генетических подходах [16, 17]. В рамках выяв­ленных случаев AMR очевидно наличие, по край­ней мере, двух клинико-иммуноморфологических фенотипов. Один из них - острый, чаще выявляе­мый в индикационных биопсиях в виде МВВ, в более ранние сроки пострансплантационного пе­риода и, как правило, сопровождающийся сниже­нием функции АП, депозитами C4d-ptc. Другой вариант AMR, наблюдавшийся нами, может быть охарактеризован как «первично хронический». В этом случае морфологические проявления актив­но текущего AMR с поражением микроциркуля­ции АП сопровождались очевидными признаками хронификации в виде ГП, несмотря на отсутствие острых, клинически значимых эпизодов в про­шлом. Такие субклинические изменения выявля­ли в достоверно более поздние сроки после АТП в сравнении с острым AMR [55 (35;78) мес и 3 (1; 14) мес], зачастую без классической депози­ции C4d-ptc. Механизмы формирования ГП могут быть связаны с постоянным воздействием неболь­ших концентраций ДСА на аллографт в течение всего посттрансплантационного периода, при­водящим к расщеплению базальной мембраны и экспансии lamina rara intema с субэндотелиальной депозицией материала, включающего иммунные комплексы при потере способности эндотелия к аккомодации [13, 18, 19].

МВВ, основное морфологическое проявление AMR, в большинстве случаев было представлено сочетанным поражением капилляров клубочка и интерстиция. В некоторых случаях находили изо­лированное поражение капилляров интерстиция или клубочка. Прогностическое значение послед­него нуждается в уточнении, однако ряд данных указывают на то, что гломерулит, включая его изо­лированные формы, может иметь более важное значение для выживаемости АП, требуя своевре­менной верификации и соответствующей насто­роженности [20, 21].

В целом, AMR, безусловно, связано с резким ухудшением прогноза выживаемости АП, в то время как значение Т-клеточного отторжения не столь очевидно и остается предметом дискуссий [2, 22]. Полученные нами при длительном наблю­дении реципиентов АП исследованной группы данные полностью подтверждают такие представ­ления. При 9-летней выживаемости АП в общей группе, составившей 79%, Т-клеточное отторже­ние не было причиной потери АП ни в одном слу­чае. В то же время, кумулятивная выживаемость АП при развитии AMR была достоверно более низкой. Приведенные наблюдения позволяют счи­тать причиной потери АП при AMR отчетливую склонность к персистированию и хронификации, несмотря на достаточно агрессивную терапию, направленную на основные патогенетические ме­ханизмы этого типа отторжения [13, 14, 23-25]. Вместе с тем, следует учесть, что выживаемость АП при ГП составила 72% за 9-летний период, что сравнимо с данными эталонных международ­ных обсервационных исследований [26] и отече­ственных данных [27] для неселекционированных по наличию отторжения групп реципиентов АП. Это является косвенным свидетельством того, что настойчивое лечение, включавшее элиминацию циркулирующих анти-HLA-антител, контроль Т- и В-клеточных иммунных реакций, угнете­ние популяции плазмацитов, может приводить к улучшению прогноза таких больных и повышать эффективность АТП. Подтверждение таких пред­положений нуждается в проведении контролируе­мых исследований.

Более радикальным подходом в будущем мо­жет быть стратегия выявления реципиентов с по­вышенным риском, основанная на поиске и иден­тификации факторов прогноза развития разных фенотипов AMR [21] и проведения превентивной терапии, эффективность которой уже продемон­стрирована на примере АВО-несовместимых АП [23].

Ограничениями исследования являются от­носительно небольшое число реципиентов АП, а также отсутствие предтрансплантационного типирования HLA по всем локусам, что могло занизить данные о частоте отторжения. Об этом свидетельствует выявление у некоторых реципи­ентов анти-HLA-антител, направленных к нетипируемым в рутинной трансплантационной прак­тике локусов DP, DQ, C, а также MICA. Приме­ненный подход с регулярным морфологическим и иммунологическим мониторингом относится к сильным сторонам исследования и в настоящее время применяется лишь в единичных трансплан­тационных центрах [9, 13, 14].

Представленные данные определенно указы­вают на то, что AMR может быть распространен­ной и недооцениваемой проблемой, связанной со снижением сроков функционирования АП и эф­фективности АТП, в целом. Своевременное выяв­ление и лечение этого типа иммунного конфликта требует рутинного проведения иммунологическо­го и морфологического мониторинга.