Диабетическая нефропатия (ДН) является одной из наиболее частых причин терминальной почечной недостаточности (ESRD) [1]. Морфо­логически это характеризуется фибротическими процессами почечной паренхимы в виде тубулоинтерстициального фиброза, гломерулосклероза и васкулярного склероза [2]. При этом прогрессия ДН достаточно часто сопровождается сочетанием с гломерулопатиями, которые существенным об­разом могут влиять на течение, прогноз и лечение пациентов [1, 3]. Однако информации о значи­мости этого влияния, в частности на выражен­ность тубулоинтерстицального фиброза, одного из основных патоморфологических прогностиче­ских критериев дисфункции почечной паренхимы [4] недостаточно.

Цель исследования: оценка возможного вклада НДГП в фибротические процессы паренхимы по­чек больных с ДН.

В исследовании были использованы ретро­спективные данные 2002-2016 гг. от 51 пациента с сахарным диабетом (СД) 2-го типа. Диагноз ве­рифицировался клинико-морфологически. Общая группа больных с ДН - группа 1, была разделена на пациентов ДН без НДГП [группа 2 (n=31)] и ДН с НДГП [группа 3 (n=20)]. У всех пациентов были выполнены стандартные лабораторные и инструментальные исследования: артериальное давление систолическое (САД) и диастоличе­ское (ДАД); креатинин в сыворотке крови (Сг), ммоль/л; суточная потеря белка (СПБ); скорость клубочковой фильтрации (по формуле CKD-EPI). Для патогистологического исследования фраг­менты почечной паренхимы фиксировались в 4% параформальдегиде на фосфатном буфере с рН 7,4 в течение 24 ч при комнатной температуре. После стандартной обработки тканевых фраг­ментов (обезвоживание, пропитка, заливка) из парафиновых блоков были приготовлены 3-4 мкм серийные срезы. Препараты окрашивались гема­токсилином и эозином, реактивом Шиффа, трихромальной окраской, по Джонсу, конго красным. Анализ патогистологических изменений: очаго­вого склероза (ОС), склерозированных клубоч­ков (ГС), гиалиноза артериол (ГА), выраженности лейкоцитарной инфильтрации в тубулоинтерстиции, (ИТИН) суммарное значение инфильтрации лимфоцитами, макрофагами, плазмоцитами, нейтрофилами, перитубулярного капиллярита (РТС), атрофии канальцев (АК) проводился полуколичественно. В зависимости от степени выраженности патологический процесс ранжировался следую­щим образом: 0 - нет изменений, 1 - до 25% ана­лизируемых срезов нефробиоптата, 2 - до 50%, 3 - более 50% анализируемого объекта. Склероз клубочков (ГС) определялся как относительное количество (%) склерозированных клубочков от общего числа клубочков в исследованных срезах. Результат патоморфологической диагностики до­кументировался как стадия ДН и вариант гломерулонефрита в соответствии с Классификацией ВОЗ, 2010 и классификацией T.WV. Tervaert et al., 2010 [5]. Артерии диаметром более 100 мкм оце­нивали посредством определения коэффициента обструкции (КО) - деления длины внутреннего диаметра сосуда (до субэндотелиальной базаль­ной мембраны) на внешний диаметр сосуда (до внешней границы средней оболочки) (рис. 1) [6].

Иммунофлюоресцентное исследование (пря­мая флюоресценция) осуществлялось на крио- статных срезах с использованием FITC меченых антител, производство фирмы «DAKO» (Дания). Во всех биопсиях анализировалась депозиция в структурах нефрона IgA, IgM, IgG, C3c, C1q, фи­бриногена, каппа и лямбда легких цепей. Иммуногистохимические реакции проводились на пара­финовых срезах толщиной 4 мкм. После депарафинизации, регидратации, необходимой высоко­температурной демаскации ингибирование эндо­генной пероксидазы проводилось в 3% растворе H2O2 на метаноле. Моноклональные антитела к α-SMA (клон 1А4, «DAKO», Дания) были приме­нены в качестве иммуноморфологических марке­ров миофибробластов. Фосфатно-солевой буфер (PBS) был использован как отрицательный кон­троль для замены первичного антитела. Срезы ин­кубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Систему детекции EnVision (К5007, «DAKO», Дания) использовали для визуализации эпитопов. В качестве визуализирующей хромогенной метки применяли диаминобензидиновую реакцию.

Для оценки активности миофибробластов (SMA) проводился количественный анализ путем подсчета SMA-позитивных клеток в 20 полях зре­ния при увеличении обьектива 40 в тубулоинтер- стиции (ТИН) каждого пациента, представленные как количество клеток на 1 мм2. Исследование проводилось в светооптическом микроскопе «Carl Zeiss Imager Z 2» (Германия). Статистическую об­работку полученных данных проводили с приме­нением стандартных пакетов программ приклад­ного статистического анализа (Statistica 8.0 for Windows). Использовались методы параметриче­ской и непараметрической статистики. Данные в таблицах представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения в случаях правильно­го распределения, медианы и межквартильного размаха при неправильном. Для сравнительного анализа между группами использовали U-тест Mann-Whitney при р<0,05. Для корреляционно­го анализа вычисляли коэффициент корреляции Спирмена (Spearman, R) при р<0,05.

Основные демографические и лабораторные характеристики показателей представлены в табл. 1.

В группах больных с ДН преобладали мужчи­ны - 62,6% от общего числа всех пациентов. До­стоверной разности между группами по возрасту не обнаружено. Средний возраст по всей когорте больных составил 49±13 лет. Суточная протеи- нурия, уровень сывороточного креатинина, СКФ и САД также не имели достоверных различий между группами. Несмотря на то, что значение стадии ДН (СДН) во 2-й группе был выше, чем в 3-й, данные различия не являлись статистиче­ски достоверными. Количество больных с ДН, отягощенных НДГП, составило в исследуемой группе 40% от общего числа (табл. 2). Первич­ные гломерулонефриты (ПГН) преобладали над вторичными (соотношение 70/30%). Наиболее ча­стой формой ПГН был ФСГС. Второй по частоте встречаемости была IgA-нефропатия. Остальны­ми нозологическими формами были мембрано­пролиферативный гломерулонефрит (МБПГН) и мембранозная нефропатия (МН). Среди вторич­ных гломерулонефритов (ВГН) наиболее часто встречался пролиферативный иммунокоплексный гломерулонефрит при гепатите С. Остальными патологиями почек были тромботическая микроангиопатия (ТМА) и болезнь отложения монокло­нальных иммуноглобулинов (MIDD).

Сравнительный анализ статистических значе­ний патоморфологических маркеров фибропла­стических процессов в почечной паренхиме ис­следованных групп статистически достоверных различий не выявил (табл. 3).

Корреляционный анализ выявил многочислен­ные связи между показателями у пациентов ис­следованных групп. Интересным, на наш взгляд, являлось отсутствие связи между SMA и КО, при наличии достоверных положительных корреляци­онных связей и с АК, ОС, ГС и СДН и отрицатель­ной с СКФ в группе 1 (табл. 4).

В группе 2 показатель активности миофибро­бластов SMA также имел достоверные положи­тельные корреляционные связи с АК, ОС, утратив при этом корреляции с ГС, СДН и СКФ. Значения SMA в группе 3 не имели корреляционных свя­зей с другими лабораторными или структурны­ми маркерами. В группе 1 патоморфологические признаки активности воспалительного процесса ИТИН и РТС были связаны между собой и струк­турными признаками фиброза ТИН, включая SMA (табл. 5). Признаки активности воспалительного процесса ИТИН и РТС в группе 2 были связаны между собой, однако РТС по сравнению с груп­пой 1 имел достоверную корреляции только с АК, ИТИН и ОС.

РТС и ИТИН в 3-й группе утрачивали взаимос­вязь, при этом у РТС сохранялись коррелятивные связи с маркерами фиброза ТИН.

В настоящей работе мы оценивали клиниче­ские и патоморфологические характеристики групп больных с СД, разделив исходную группу на больных без НДГП и осложненным дополни­тельными патологиями т.е. НДГП. В результате соотношение сочетанных и несочетанных форм ДН получилось 40/60%. Эти данные частично со­гласуются с мнением других авторов [7,8], хотя они отмечают меньшее количество ДН, отяго­щенных гломерулонефритами. Что касается ва­риантов гломерулонефритов, которые осложняют течение ДН, то, по нашим данным, преобладали ПГН, в частности ФСГС и IgA-нефропатия. Наши данные не совсем соответствуют данным других авторов, в которых преобладают IgAN [1, 9], хотя и у наших пациентов IgA-нефропатия была по количеству случаев на втором месте. Если анали­зировать лабораторные показатели дисфункции почек, то у наших больных статистически досто­верных различий между 2-й и 3-й группами вы­явлено не было. Хотя в группе 2 такие показатели, как более низкий уровень СКФ и повышенный уровень Cr, совпадали с более тяжелой морфоло­гической стадией СДН по сравнению с группой 3 (см. табл. 1). Эти значения частично соотносят­ся с данными патоморфологического исследова­ния групп 3 и 2, где во 2-й группе значения АК и активности миофибробластов SMA были стати­стически недостоверны по сравнению с другими группами (см. табл. 3). α-SMA является микрофиламентозным актином, находящимся в миофибробластах. Эти клетки ответственны за продук­цию внеклеточного матрикса почками в условиях патологии [10]. Высокая экспрессия α-SMA от­ражает количество миофибробластов и степень выраженности фиброза, в том числе при ДН [2]. Наши исследования SMA не выявили статистиче­ски достоверной разницы между группами 2 и 3, хотя значения SMA были несколько выше в груп­пе 2. В то же время, при корреляционном анали­зе были документированы положительные связи SMA с АК, ОС, ГС и СДН в группе 2 в отличие от 3-й группы больных (см. табл. 4). На наш взгляд этот связано с тем, что производные метаболитов глюкозы могут существенным образом стимули­ровать дифференцировку и активацию миофибробластов, модулируя фибропластические процессы в тубулоинтерстиции [11]. Влияние же НДГП на этот процесс остается на настоящий момент не совсем ясным. Ряд авторов рассматривают ДН как воспалительное заболевание [12], что вполне объ­яснимо, так как воспалительные реакции сопро­вождают течение заболевания в виде инфильтра­ции ТИН лейкоцитарными клетками и активацией различных цитокинов [13]. В связи с этим мы про­вели анализ патоморфологических маркеров вос­палительных реакций в ТИН: ИТИН и РТС. Срав­нительный анализ не дал достоверных различий между группами, хотя показатель РТС в группе 2 явно был выше, чем в других группах. Закономер­ным на наш взгляд были результаты корреляцион­ного анализа, который показал многочисленные связи ИТИН и РТС с параметрами склероза ТИН. В основном это были положительные связи. Не­смотря на схожесть различий в характере и вари­антах корреляций между группами, взаимосвязь между ИТИН и РТС в 3-й группе отсутствовала. Кроме того, в группе 3, в отличие от группы 2, вы­являлись положительные корреляционные связи, в частности с ГА, САД, Cr, что может свидетель­ствовать о дополнительном негативном влиянии НДГП на состояние ТИН у пациентов с ДН и быть прогностическим предиктором течения заболева­ния. Эти данные, с одной стороны, демонстриру­ют активное участие воспалительных реакций в реализации склеротических процессов ТИН при СД, с другой стороны - свидетельствуют о том, что НДГП определенным образом могут изменять типичную для ДН конфигурацию местных воспа­лительных реакций в ТИН.

В таблице представлены значения коэффициента корреляции Спирмена. Жирным шрифтом выделены значения статисти­чески достоверной корреляции при р<0,05.

Таким образом, процессы фиброзирования ТИН в почке при ДН сопровождаются измене­ниями в исследованных группах больных таких патоморфологических маркеров, как активность миофибробластов-SMA и РТС. Их определение может дополнить уже хорошо известные преди­кторы прогрессии тубулоинтерстициального фи­броза почки при ДН.