Мочевой протеом является потенциальным ис­точником информации при заболеваниях почек [1]. По данным протеомного анализа в образце мочи может присутствовать от 900 до 2500 раз­личных белков и полипептидов [2]. В лабора­торной практике принято оценивать суммарную экскрецию всех белков с мочой - протеинурию. Суммарная концентрация белков в моче - важный диагностический показатель, который входит в рутинный анализ мочи, в то же время, оценка протеинурии не дает ответа на некоторые вопросы, например, о локализации повреждения нефрона. В настоящей работе мы дополнили анализ протеинурии идентификацией высокомолекулярных [трансферрин (Trf), иммуноглобулин G (IgG)] и низкомолекулярных [α1-микроглобулин (а1-МГ), Р2-микроглобулин (β2-ΜΓ)] белков, мочевая экс­креция которых может отражать два основных ва­рианта протеинурии - нарушение проницаемости гломерулярного фильтра и снижение реабсорбции в канальцах [3, 4]. Целью работы было исследова­ние взаимосвязи между мочевой экскрецией вы­сокомолекулярных и низкомолекулярных белков и необратимыми фибропластическими измене­ниями в клубочках и тубулоинтерстиции у паци­ентов с иммунными гломерулопатиями.

В исследование были включены 97 пациентов старше 18 лет с первичными иммунными гломе- рулопатиями, подтвержденными морфологически (мужчин - 49, женщин - 48, средний возраст 43±16 лет). Обследование проведено до начала иммуносупрессивной терапии (ИСТ). Основные клинико­демографические показатели исследуемой группы представлены в табл. 1. Критериями исключения были острое повреждение почек, инфекционные заболевания, сердечная/легочная недостаточность, онкологические заболевания, ИСТ. В контрольную группу вошли 20 здоровых добровольцев (мужчин - 9, женщин - 11, средний возраст 35±12 лет). Ис­следование было одобрено локальным этическим комитетом ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Накануне проведения биопсии почки пациен­там назначали взятие образца венозной крови и утренней мочи. Кровь и мочу центрифугировали при 1500 g в течение 10 мин, после чего биома­териал аликвотировали и хранили при температу­ре -80 °С до проведения исследований. Биоптат почки фиксировали в 5% нейтральном формали­не при температуре 22 °С в течение 16 ч. Гисто­логическую проводку осуществляли с помощью автоматического процессора Tissue-Tek Vip 5Jr («Sakura Finetek Inc.», США) с применением рас­твора IsoPREP («БиоВитрум», Россия). Для про­питывания обезвоженной ткани и приготовления гистологических блоков применяли среду для заключения HISTOMIX («БиоВитрум», Россия). Срезы толщиной не более 4 мкм изготавливали на ротационном микротоме Accu-cut SRM («Sakura Finetek Inc.», США). Для всех микропрепаратов применяли окрашивание гемотоксилином и эо­зином, трихромную окраску по Массону, окра­ску конго красным, PAS-реакцию, серебрение по Джонсу. При световой микроскопии количествен­но оценивали долю склерозированных клубочков с признаками сегментарного и глобального скле­роза. Выраженность фибропластических изме­нений тубулоинтерстиция оценивали полуколичественно в баллах (0 - <10%; 1 балл - 10-25%; 2 балла - 26-50%; 3 балла ->50%) (морфолог В.Г. Сиповский).

Биохимические исследования

Концентрацию низко- и высокомолекуляр­ных белков измеряли в образцах утренней мочи. Концентрацию альфа1-микроглобулина (а1-МГ), бета2-микроглобулина ф2-МГ), иммуноглобули­на G (IgG), трансферрина (Trf) в моче определяли на иммунохимическом анализаторе специфиче­ских белков «Immage 800» («Beckman Coulter», США) с двойной системой детекции - кинетиче­ская нефелометрия и турбидиметрия в ближнем инфракрасном диапазоне (NIPIA). Определение протеинурии проводили методом с пирогаллоло- вым красным на автоматическом биохимическом анализаторе «Synchron CX9» («Beckman Coul­ter», США). Для стандартизации результатов рассчитывали мочевую экскрецию белков как от­ношение белок/креатинин (мг/ммоль). Определе­ние креатинина проводили модифицированным методом Яффе путем регистрации кинетики реакции, прослеживаемость калибратора до NIST SRM914a. Расчет СКФ производили по формуле CKD EPI [5], клиренса креатинина (CCr) - по пробе Реберга.

Статистический анализ

Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха. Для сравнения средних значений в двух выборках применяли критерий Манна-Уитни. Для исследования связей между переменными рассчитывали коэффициент корре­ляции Спирмена. Межгрупповые различия и ре­грессионные коэффициенты считали статистиче­ски достоверными при значении p<0,05.

У всех пациентов с первичными иммунными гломерулопатиями выявлены выраженная протеинурия и высокая мочевая экскреция специфиче­ских белков (табл. 2).

Для пациентов с подоцитопатиями (МН, БМИ и ФСГС) были характерны более высокая протеинурия, мочевая экскреция трансферрина и низко­молекулярных белков (β2-ΜΓ и αΙ-МГ) в срав­нении с IgA-нефропатией. Уровень IgG в моче в исследуемых группах достоверно не различался. В группах БМИ, МН и ФСГС не было выявлено существенных различий между исследуемыми протеинами, а также соотношением IgG/Trf, отра­жающим селективность протеинурии.

Между уровнем протеинурии и экскрецией крупномолекулярных белков - Trf, IgG и низко­молекулярных белков - α1-МГ и β2-МГ выяв­лены высокодостоверные прямые взаимосвязи (табл. 3).

В отличие от Trf и IgG низкомолекулярные бел­ки мочи (β2-МГ и αΙ-МГ) были обратно связаны с индексами клубочковой фильтрации (табл. 4). Ни уровень протеинурии, ни мочевая экскреция высокомолекулярных протеинов (Trf и IgG) не имели достоверных связей с выраженностью фи­бропластических гломерулярных изменений. На­против, β2-МГ и αΙ-МГ прямо коррелировали с выраженностью глобального склероза клубочков (см. табл. 4).

Экскреция β2-МГ была значительно выше в подгруппах с умеренной и выраженной тубу­лярной атрофией, интерстициальным фиброзом, эластофиброзом артерий, периваскулярным скле­розом (табл. 5). В тех же подгруппах уровни про­теинурии и остальных исследуемых белков до­стоверно не отличались.

В нашем исследовании уровень протеинурии и концентрации исследуемых специфических бел­ков, стандартизированных по креатинину мочи, коррелировали друг с другом и были значитель­но повышены у пациентов во всех исследуемых группах (см. табл. 2). Высокие уровни IgG и Trf свидетельствовали о выраженном нарушении проницаемости гломерулярного фильтра с поте­рей селективности по размеру белковых молекул во всех группах, что характерно для протеинурических гломерулопатий [6-8]. Небезынтересно, что при БМИ, для которой, согласно классиче­ским представлениям, должна быть характерна селективная альбуминурия, значения мочевой экскреции IgG, Trf и их отношение достоверно не отличались от других вариантов гломерулопатий.

Нами не было обнаружено корреляции высоко­молекулярных белков с глобальным или сегментар­ным склерозом клубочков, при этом экскреция IgG была отрицательно ассоциирована с индексами клубочковой фильтрации - клиренсом креатинина и рСКФ. Интересно, что в отличие от классических представлений, нами была обнаружена связь уров­ней а1-МГ, β2-МГ, общепринятых маркеров ка­нальцевого повреждения, с глобальным склерозом клубочков (см. табл. 4). Полученные нами резуль­таты согласуются с недавними экспериментальны­ми данными, свидетельствующими о том, что кон­центрация β2-МГ в моче связана с гломерулярным повреждением [9]. Реабсорбция а1-МГ, β2-МГ, как и многих других белков в проксимальных каналь­цах осуществляется, главным образом, посред­ством рецептор-опосредованного эндоцитоза, что предполагает возможность конкуренции за связы­вание с рецепторами комплекса мегалин-кубилин [10, 11]. При достаточном количестве рецепторов путем канальцевой реабсорбции поддерживается невысокий уровень а1-МГ и β2-МГ в моче. При по­вреждении клубочков, потеря альбумина и других плазменных белков приводит к перенасыщению и дефициту рецепторов, что может объяснять рост уровней низкомолекулярных белков при гломерулопатиях и корреляцию их экскреции с гломеру­лярным повреждением [10].

N. Pallet и соавт. указывают на отсутствие свя­зи между уровнями высокомолекулярных белков и повреждением тубулоинтерстиция (ТИ) у паци­ентов с хронической болезнью почек при ассоциа­ции интерстициального фиброза с уровнями низ­комолекулярных белков - а1-МГ, β2-МГ [12]. Мы также не нашли связи между уровнями высоко­молекулярных белков (IgG, Trf) и выраженностью повреждения ТИ и более высокую мочевую экс­крецию β2-МГ у пациентов с умеренными и вы­раженными фибропластическими изменениями ТИ и атрофией канальцев. Кроме того, впервые показано, что уровень β2-МГ в моче повышен при существенной фиброплазии артериальных сосу­дов почки (см. табл. 5).

В норме β2-МГ свободно фильтруется в клу­бочках, реабсорбируется и катаболизируется в проксимальных канальцах (ПК), в то время как при тубулярном повреждении ТИ уровень β2-МГ в моче повышается [7]. Вместе с тем, объяснения патогенетического и прогностического значения β2-МГ при иммунных гломерулопатиях могут вы­ходить за пределы механистических представле­ний о его возможности быть маркером процесса тубулярного проксимального транспорта. β2-МГ имеет многообразные функции, среди которых: межклеточные взаимодействия с участием мо­лекул главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, МНС) и МНС- подобных молекул, активации Т- и В-клеточных иммунных реакций и фиброгенеза, трансцеллю- лярного транспорта и увеличения периода полужизни альбумина и IgG с участием неонатального Fc-рецептора (FcRn) [13]. В контексте патогенеза гломерулопатий эти функции β2-ΜΓ могут иметь отноше­ние к процессам транспорта, активации и межклеточных взаимодействий тубулярного эпителия и подоцитов [9]. Согласно результатам J.P. Haymann и соавт., FcRn экспрес­сируется в эпителиальных клетках гломерул и щеточной кайме клеток ПК [14]. β2-МГ способен нековалентно свя­зываться с FcRn, экспрессирующимся в почках [15]. Ав­торы предполагают, что в ПК FcRn опосредует эндоцитоз IgG в комплексе с β2-MГ, в результате чего может проис­ходить удаление этих белков из первичной мочи [14, 16]. При этом транспорт глобулинов FcRn носит рН-зависимый характер [16]. При повреждении почек и воспалительном процессе происходит смещение pH, образование комплек­са нарушается, что, вероятно, приводит к снижению ка­нальцевой реабсорбции и повышению уровней β2-МГ и IgG в моче. Имеются некоторые свидетельства того, что система FcRn подоцитов функционирует как иммунный сенсор, связанный с активирующим фосфорилированием p38 MAPK (р38 mitogen-activated protein kinases) и воспалительной реакцией, наблюдаемой при некоторых гломерулопатиях [17]. По-видимому, p38 MAPK являет­ся основным профибротическим сигнальным путем при диабетической нефропатии [18], нефротическом синдро­ме [19], почечной гипертензии [20], торможение которого приводит к снижению артериального давления, склероза, повреждения и апоптоза подоцитов [21]. Следовательно, β2-MГ-ассоциированная активация FcRn при гломеру- лопатиях может иметь отношение к патогенетическим механизмам развития фиброза клубочков, ТИ и сосудов. Подобные предположения, очевидно, нуждаются в допол­нительной проверке.

Таким образом, показано, что β2-МГ может рассма­триваться как кандидатный интегральный биомаркер, указывающий на выраженность фибропластических из­менений клубочков, тубулоинтерстиция и сосудов при гломерулопатиях.

Авторы выражают признательность за техническую по­мощь в подготовке публикации Елене Николаевне Левыкиной.