ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ НАРУШЕНИЙ ИММУННОГО ОТВЕТА У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА С ОСТРЫМ ПИЕЛОНЕФРИТОМ

ВВЕДЕНИЕ

Острый пиелонефрит (оПН) - это инфекционно­воспалительный процесс, протекающий преиму­щественно в чашечно-лоханочной системе почки и тубулоинтерстициальной зоне [1]. Чаще всего заболевание вызывают представители семейства Enterobacteriaceae. Основным путем инфициро­вания является восходящий. Известно, что среди больных с оПН преобладают женщины. Это обу­словлено рядом предрасполагающих факторов, таких как короткий и широкий мочеиспускатель­ный канал, расположенный в непосредственной близости к естественным резервуарам инфек­ции - анусу и влагалищу. Особенно высокий риск возникновения инфекции мочевыводящих путей отмечен у двух групп риска. Во-первых, это жен­щины репродуктивного возраста, ведущие актив­ную половую жизнь, с частой сменой партнеров, контрацепцией спермицидами. Во-вторых - бе­ременные, у которых изменяются угол наклона мочевого пузыря и развиваются гипотония моче­выводящих путей, дисфункция сфинктеров и недержание/неудержание мочи [2, 3].

Немаловажную роль в патогенезе оПН играют различные нарушения иммунной системы (дефек­ты клеточного и гуморального звеньев иммуните­та) [4]. Слизистая оболочка мочевыводящих пу­тей и лоханок становится легко проницаемой при совпадении по времени ряда факторов, а именно: проявления вирулентных свойств бактерий, неа­декватности иммунной реакции организма, нару­шении уродинамики [5].

Развитие воспалительного процесса в почках всегда связано с нарушением иммунного ответа, проявляющегося снижением защитных свойств локальных звеньев иммунной цепи, фагоцитарных свойств гранулоцитов (макрофагов), массивным высвобождением провоспалительных цитокинов и др. Концентрация в сыворотке крови цитокинов IL-1 и IL-6 повышается в первую очередь, поэтому их относят к маркерами воспаления. IL-Ιβ является ключевым цитокином в регуляции иммунных про­цессов посредством участия в развитии острого и хронического воспаления, а генетически детерми­нированный полиморфизм коррелирует с измене­ниями в развитии иммунного ответа и сопровожда­ется увеличением частоты инфекционных заболе­ваний [6]. По данным литературы, концентрация интерлейкинов в крови пропорциональна степени тяжести пиелонефрита [7].

Иммунный ответ против различных патогенов в первую очередь начинается с активации врож­денного иммунитета. Одним из важнейших его звеньев считают фазу распознавания молекуляр­ных структур микроорганизмов с помощью Toll- подобных рецепторов (TLR). TLR представляют собой интегрированные трансмембранные гликопротеины с поверхностными рецепторами, от­ветственными за связывание с поверхностными структурами микроорганизмов - липопротеинами, липополисахаридами, флагеллином. Напри­мер, на поверхности Escherichia coli экспресси­руются адгезины, которые в дальнейшем связы­ваются с эпителиальными клетками мочевыводя­щих путей и почек. В процессе эксперименталь­ных исследований было доказано, что почечный воспалительный ответ на бактерии E.Coli зависит от TLR-4. Этот рецептор расположен на клетках мочевого пузыря и канальцев почек и индуцирует пути выработки провоспалительных цитокинов, а также интерферона 1-го типа [8, 9].

На сегодняшний день актуальным является изучение генетических маркеров нарушений им­мунного ответа, а также предрасположенности к инфекциям почек и мочевыводящих путей.

Целью настоящего исследования явилось изу­чение у женщин репродуктивного возраста, стра­дающих оПН, генетически детерминированных изменений Toll-подобного рецептора-4, мутаций в генах IL-Ιβ, IL-6.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Отбор больных проводили на базе нефрологического отделения ГБУЗ Республики Крым «Сим­феропольской городской клинической больницы №7». Под наблюдением была группа больных женщин репродуктивного возраста с оПН (26 че­ловек). Средний возраст обследованных составил 29,6 ± 4,7 года. Диагноз устанавливали на основа­нии типичных клинических проявлений (болевой синдром со стороны почек, гипертермия, дизурические расстройства, ознобы, слабость, утомляе­мость, плохой аппетит, головные боли, миалгии, артралгии), изменений в анализе мочи [возможен мочевой синдром с лейкоцитурией (при наличии 10 клеток и более), бактериурией, иногда микро­гематурией]. Именения в ОАМ определяли путем микроскопии мочевого осадка, а также проводили пробу Нечипоренко (норма - лейкоциты до 4000 в 1 мл). Идентификацию возбудителей производи­ли методом культурального исследования мочи. Бактериурия диагностировалась при количестве бактерий свыше 10⁴ КОЕ в 1 мл мочи. В 80,8% случаев возбудителем являлась E.Coli. Также об активности воспалительного процесса свиде­тельствовали: лейкоцитоз более 9x10⁹/л и палоч­коядерный сдвиг в формуле крови. 19 больных (73,1%) страдали острым неосложненным пие­лонефритом. При ультразвуковом исследовании у них структурных аномалий почек и мочевы­водящих путей выявлено не было. У 7 больных (26,9%) имелся нефроптоз или удвоение чашечно­лоханочной системы.

Критериями исключения являлись возраст старше 45 лет, наличие хронических инфекционно­воспалительных заболеваний мочевыводящих путей, мочекаменной болезни, врожденных ано­малий развития мочеполовой системы, сахарного диабета, беременности. Группа контроля состояла из 27 женщин, сопоставимых по возрасту, практи­чески здоровых, не имевших в анамнезе эпизодов инфекций почек и мочевыводящих путей.

В лаборатории молекулярной биологии Цен­тральной научно-исследовательской лаборатории Медицинской академии им. С.И. Георгиевского, ФГАОУ ВО «Крымского федерального универси­тета им. В.И. Вернадского» г. Симферополя мето­дом ПЦР осуществлялось изучение генетического полиморфизма IL-1β, IL-6 и TLR-4. Путем аллель­ного исключения с помощью наборов производства фирмы ООО НФП «Литех», Москва, использовал­ся метод регистрации флюоресценции в режиме реального времени с добавлением в реакционную смесь флюоресцентного красителя SYBR-Green в рекомендуемой концентрации. Результаты каж­дого эксперимента регистрировались на амплификаторе «Терцик МС2» методом электрофореза в 3% агарозном геле, в 0,1 М буферном растворе трис-борной кислоты, рН 8,6, в присутствии бро­мистого этидия, а также электрофорезом в 2% геле агарозы и в режиме реального времени, СFX-96 по флюоресценции при 524 нм. Выделение образцов ДНК из крови осуществлялось с помощью фенол- хлороформного метода [10].

Статистический анализ полученных дан­ных проводили с использованием пакетов стан­дартных прикладных программ «Statistica v6.0» («StatSoft Inc», США), «Microsoft Excel, 2007» («Microsoft Corporation», США).

Результаты представлены в виде среднего арифметического ± ошибка средней. Статистиче­скую значимость различий двух средних опреде­ляли с помощью t-критерия Стьюдента. Оценку соответствия наблюдаемого и ожидаемого рас­пределения генотипов при равновесии Харди-Вайнберга проводили с применением критерия Пирсона (χ²). Рассчитывали отношения шансов (ОR) и его доверительный интервал при уровне значимости 95%.Нулевую статистическую гипо­тезу об отсутствии различий и связей отвергали при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При определении полиморфизма гена IL-1 β, при котором происходит замена цитозина (С) на тимин (Т) в -31 участке ДНК, обозначается как генетический маркер T(-31)C. Возможны раз­личные генотипы: СС, СТ и ТТ. При сравнении частоты аллельных вариантов промоторной об­ласти T(-31) C гена IL-1b в группе больных чаще встречается аллель Т [достоверно р=0,0578 (р<0,05) по сравнению с группой контроля], и на­личие генотипа СТ. Это можно рассматривать как повышенную вероятность возникновения воспалительного процесса в мочевых путях. У здо­ровых лиц, наоборот, преобладают гомозиготы СС р=19,32 (р<0,05) в полиморфизме гена IL-1b (табл. 1).

Доказано, что у носителей мутантного аллеля синтез интерлейкина-1 происходит активнее, вы­зывая усиление воспалительного процесса как в мочевыводящих путях, так и во всем организме.

Известно, что при активации TLR на поверх­ности клетки запускается каскад реакций, направленных на активацию процессов врожденного иммунитета: экспрессия антимикробных факто­ров, медиаторов воспаления (IL-1, IL-6, ФНО-α), а также других генов, ответственных за дифференцировку и регуляцию апоптоза [11]. При наличии различных мутаций в гене Toll-подобных рецеп­торов (в частности, TLR-4) происходит наруше­ние нормальной работы иммунной системы. В одном случае может произойти инактивация мо­лекул для передачи сигналов запуска каскада про- и противовоспалительных реакций, что послужит причиной угнетения иммунной системы. При другом варианте генетического дефекта актив­ность иммунной системы, наоборот, может увели­читься, что наблюдается при ряде аутоиммунных заболеваний, таких как бронхиальная астма, забо­левания соединительной ткани и др. [12].

При сравнении частоты аллельных вариантов замены аспарагина на глицин в 299-й позиции гена TLR-4 в группе больных и практически здо­ровых лиц оказалось, что частота встречаемости аллеля G коррелирует с повышением риска забо­левания пиелонефритом, а частота встречаемости аллеля А, напротив, повышается в контрольной группе (табл. 2).

У лиц с выраженным воспалительным процес­сом преобладал генотип GG, у здоровых больше встречается генотип АА. Сочетание аллелей AG в одинаковой степени сопровождается повышен­ным риском возникновения инфекционного про­цесса, в том числе пиелонефрита.

При изучении распределения частот геноти­пов C(-174)G гена IL-6 статистически значимых различий выявлено не было (табл. 3). Гомозиготы GG, СС, гетерозиготы GC наблюдались в одина­ковой степени как у больных с оПН, так и в груп­пе контроля.

ОБСУЖДЕНИЕ

Острый пиелонефрит является инфекционно­воспалительным процессом, вызванным в боль­шинстве случаев E.Coli. В современной научной литературе есть указания на то, что патологиче­ский воспалительный процесс и иммунный ответ на него во многом детерминируются генетически­ми нарушениями [13]. Так, при наличии дефектов в генах Toll-подобного рецептора, отвечающего за экспрессию антигенов на поверхность кле­ток и активацию про- и противовоспалительных реакций, воспалительный процесс протекает более активно. Изучено, что наличие гомозиго­ты GG в промоторной области Arg299Gly гена TLR-4 вызывает нарушения запуска каскада противовоспалительных реакций [14]. Также из­менения гена IL-1b [гомозиготы ТТ и гетерозиго­ты СТ в промоторной областиТ(-31)С] позволя­ют установить предрасположенность к развитию оПН. В связи с тем, что репродуктивный возраст женщин относят к факторам риска развития ин­фекций мочевыводящих путей и, в частности, пиелонефрита, то для прогнозирования вероят­ного инфекционно-воспалительного процесса в почках целесообразно исследовать именно эти генетические маркеры. Изучение распределения частот генотипов C(-174)G гена IL-6 достовер­ных результатов не дало, вероятно для получения статистически отличимых показателей требуется большее количество наблюдений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У женщин репродуктивного возраста с оПН выявлена высокая распространенность полимор­физма генов IL-1β и TLR-4.

Генотипы ТТ, CT и полиморфизма гена Т(-31)С IL-1β и генотип GG полиморфизма гена Asp299Gly TLR-4 ассоциированы с повышенным риском воз­никновения инфекционно-воспалительного про­цесса в почках.

У здоровых лиц встречаются генотипы СС для гена Т(-31)С IL-1β и АА для гена Asp299Gly TLR-4.

Женщинам репродуктивного возраста целе­сообразно проводить генетическую диагностику для прогнозирования возникновения инфекцион­ного процесса и проведения профилактики.