ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ CD3+, CD68+, CD20+ КЛЕТОК В ИНТЕРСТИЦИИ У БОЛЬНЫХ С ГЛОМЕРУЛИТОМ АЛЛОГРАФТА ПОЧКИ

ВВЕДЕНИЕ

Выживаемость аллографта почки (АП) зави­сит от выраженности иммунологического кон­фликта между организмом реципиента и донор­ским органом [1-3]. Основными проявлениями аллоиммунных реакций в трансплантате являют­ся Т-клеточное и В-клеточное отторжение [4, 5], однако существуют и другие фенотипы иммун­ного конфликта [6]. К одним из них относится эндотелиально-лейкоцитарная реакция в клубоч­ках - гломерулит, развитие которого ассоциирова­но со снижением выживаемости АП вне зависи­мости от наличия других признаков отторжения [7]. Интракапиллярное воспаление клубочков за­частую сочетается с инфильтрацией в интерстиции, которая, в свою очередь, может быть нега­тивным предиктором выживаемости аллографта почки [8]. Опубликованных данных о прогности­ческом значении и составе инфильтратов в интерстиции у реципиентов с гломерулитом мы не наш­ли. Целью представляемого исследования была проверка предположения о связи выраженности интерстициальной инфильтрации отдельными субпопуляциями иммунных клеток и отдаленного прогноза аллотрансплантации почки (АТП).

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследуемая группа пациентов

В ретроспективное обсервационное исследо­вание были включены 86 реципиентов АП, полу­чивших трансплантат в 2000-2013 гг. в соответ­ствии с критериями: наличие в индикационной или протокольной биопсии гломерулита по опре­делению Banff [5], совместимость с донором по группе крови, отрицательный цитотоксический кросс-матч тест. Критериями исключения были: морфологические признаки возврата первичной патологии почек, полиомавирусная инфекция (подтвержденная иммуногистохимически), ча­стые рецидивирующие инфекции мочевого трак­та после АТП. СКФ на момент биопсии с гломерулитом была определена по формуле MDRD. Основные клинико-демографические параметры пациентов, включенных в исследование, пред­ставлены в табл. 1.

Морфологический и иммунологический анализ

ДСА в сыворотке пациентов на момент биоп­сии АП с гломерулитом и морфологические пара­метры были определены с использованием мето­дологии, описанной ранее [9]. На основании на­личия/отсутствия ДСА пациенты были разделены на подгруппы: ДСА+ (n=22), ДСА- (n=53). В 11 случаях на момент биопсии ДСА не были опреде­лены (ДСА?) в связи с техническими ограниче­ниями. Медиана от АТП до биопсии с гломерули­том составила 29 (9; 93) дней. Морфологические параметры оценивали в соответствии с критерия­ми Banff (табл. 2). Между подгруппами ДСА+ и ДСА- достоверных различий по представленным показателям (см. табл. 2) выявлено не было.

Иммуногистохимическое исследование био- птатов (ИГХ) проводили по стандартным мето­дикам, также описанным ранее [9]. Использовали первичные моноклональные мышиные антите­ла, специфичные к CD68 (маркер моноцитарно- макрофагальных клеток), CD3 (маркер Т-лимфоцитов) и CD20 (маркер В-лимфоцитов) антигенам.

Для количественной оценки интерстициальной инфильтрации производили подсчет суммарного количества клеток в интерстиции и перитубуляр- ных капиллярах коркового вещества в 20 после­довательных полях зрения средней зоны биоптата, исключая субкапсулярные и периваскулярные зоны, при увеличении 400. Рассчитывали среднее число CD68+ и CD3+ клеток на поле зрения. При наличии CD20+ клеток в интерстиции для оценки выраженности инфильтрации определяли среднее количество CD20+ лимфоцитов в инфильтрате.

Иммуносупрессивная терапия, период на­блюдения и исходы

В случаях наличия ДСА на момент биопсии с гломерулитом проводили соответствующую им- муносупрессивную терапию (ИСТ), описанную ранее [7]. Тактика ИСТ, примененная в случаях гломерулита с отсутствием данных о наличии ДСА, также изложена в предыдущих работах [7].

Медиана периода наблюдения от биопсии со­ставила 54 (12; 77) мес. Комбинированная конеч­ная точка включала два исхода: потерю АП с воз­вратом на диализ или СКФ по формуле MDRD < 15 мл/мин/1,73 м².

Статистический анализ

Данные представлены как среднее и стандарт­ное отклонение (M±SD), медиана с интерквартильным размахом [m (25-75 %)]. Для анализа разли­чий между оцениваемыми параметрами в группах применяли непараметрический критерий Манна- Уитни, точный тест Фишера и критерий χ² Пирсона при анализе таблиц сопряженности, коэффициент корреляции Спирмена для оценки связи между по­казателями. Анализ выживаемости АП производи­ли с помощью метода Каплана-Майера. Дату смер­тельного исхода, наступившего при наличии функ­ционирующего АП, учитывали как конец наблюде­ния, а такой случай как цензурированный. Для вы­явления различий между кривыми выживаемости использовали Log-rank тест. Регрессионный анализ Кокса применяли для оценки прогностической значимости изучаемых факторов с коррекцией по другим потенциальным факторам риска потери АП путем их принудительного включения в анализ. В мультивариантном регрессионном анализе исполь­зовали показатели, которые имели связь с риском потери АП в одновариантном анализе при p < 0,05.

Критический уровень значимости для всех статистических тестов и коэффициентов регрес­сии принимали равным 0,05. Для статистической обработки данных использовали пакеты приклад­ной статистической программы SPSS for Windows 23.0 (IBM Chicago, IL, USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Клеточный состав интерстициальных ин­фильтратов

Медиана уровня CD3+ лимфоцитов соста­вила 18 (10; 30), а CD68+ - 13 (6; 24) клеток на поле зрения. Степени инфильтрации интерстиция CD3+ и CD68+ клетками значимо не различались. Инфильтраты CD20+ клеток в интерстиции были выявлены в 60 % (n=49) случаев, в 9 из них ин­фильтраты достигали значительных размеров (более 50 CD20+ клеток на инфильтрат) с формиро­ванием нодулярных структур (рис. 1, Б).

При сравнении степени инфильтрации CD68+ и CD3+ клетками интерстиция между подгруп­пами ДСА+ и ДСА- различия выявлены не были (рис. 2). В подгруппе с ДСА+ инфильтраты CD20+ лимфоцитов были обнаружены в 64 % биопсий, с ДСА— в 45 % (Fisher exact test p > 0,05).

Интерстициальная инфильтрация и интрагломерулярное воспаление

Между выраженностью инфильтрации интер­стиция CD68+ и СD3+ лейкоцитами были выяв­лены достоверные прямые взаимосвязи (табл. 3). Кроме того, уровень CD68+ клеток в интерстиции имел прямые связи с количеством CD3+ и CD68+ клеток в клубочках, уровень CD3+ клеток в ин­терстиции - с количеством CD3+ клеток в клу­бочках, тогда как наличие значительных СD20+ инфильтратов не было связано с уровнями CD3+ и CD68+ клеток (см. табл. 3).

Анализ выживаемости

Достоверные отличия в выживаемости АП были выявлены при сравнении групп с различной степенью инфильтрации CD68+ и CD3+ клетка­ми интерстиция. Уровень CD68+ клеток в интер­стиции ≥ 5 на поле зрения был ассоциирован со снижением выживаемости АП, как и наличие ≥ 8 СD3+ лимфоцитов на поле зрения (рис. 3, А, Б). Наличие инфильтратов CD20+ клеток не влияло на прогноз (см. рис. 3, В), однако выживаемость АП при наличии CD20+инфильтратов значи­тельных размеров была достоверно ниже (см. рис. 3, Г).

Унивариантный регрессионный анализ Кокса показал, что относительный риск потери АП до­стоверно возрастает при уровне CD68+ клеток в интерстиции ≥ 5 на поле зрения, CD3+ ≥ 8 на поле зрения, наличии значительных CD20+ инфильтра­тов, увеличении времени холодовой и тепловой ишемии АП, наличии ДСА (табл. 4).

В мультивариантных моделях показатели уровней CD3+, CD68+ клеток в интерстиции и на­личие значительных CD20+ инфильтратов имели достоверную и независимую связь с риском по­тери АП (табл. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ

Интерстициальная инфильтрация является частой находкой при морфологическом исследо­вании АП [10], в том числе при наличии призна­ков отторжения - Т-клеточного или антительно-опосредованного [10, 11]. Не будучи специфич­ным показателем отторжения [12], интерстици­альная инфильтрация способна оказывать влия­ние на отдаленный прогноз выживаемости АП [13]. Можно полагать, что субпопуляционный состав интерстициальной инфильтрации в соче­тании с другими патоморфологическими измене­ниями отражает различные механизмы клеточных взаимодействий в трансплантате и, соответствен­но, в различной степени связан с прогнозом АП.

В данное исследование были включены слу­чаи, селекционированные по наличию гломерулита - неблагоприятного в прогностическом пла­не морфологического фенотипа, отражающего активную эндотелиально-лейкоцитарную реак­цию в капиллярах клубочка. Интерстициальная инфильтрация была выявлена в 70 % случаев.

Основными клетками, участвующими в образо­вании инфильтрации, были Т-лимфоциты (CD3+) и клетки моноцитарно-макрофагального ряда (CD68+). CD3+ и CD68+ клетки могли распола­гаться по отдельности, а также находиться в со­ставе инфильтратов. CD20+ лимфоциты имели отчетливую склонность к образованию инфиль­тратов, даже при незначительном количестве кле­ток (см. рис. 2).

В двух недавно произведенных исследовани­ях было выявлено независимое влияние на вы­живаемость АП повышенного уровня CD68+ клеток в интерстиции АП [11, 14]. Sicard et al показали самостоятельное отрицательное про­гностическое значение CD68+ инфильтрации интерстиция в группе неселекционированной по наличию и виду отторжения, а подсчет уровня клеток был произведен во всех компартментах ор­гана, включая клубочки [11]. Роль моноцитарно- макрофагальных клеток в развитии гумораль­ного аллоиммунитета известна [15-19]. Уровень CD68+ в интерстиции был независимым прогно­стическим фактором выживаемости АП в группе с антительно-опосредованным отторжением [14]. Мы установили, что уровень CD68+ и CD3+ кле­ток в интерстиции при гломерулите может быть негативным предиктором долгосрочной выживае­мости АП независимо от наличия других суще­ственных факторов, в том числе ДСА.

Популяция CD68+ клеток может участвовать в инициации аллоиммунного ответа, распознавая антигены АП и представляя их Т-лимфоцитам [20, 21]. Активированные CD68+ клетки могут экс­прессировать интерлейкины 1, 6, 12, интерферон-γ и фактор некроза опухоли α, участвующие в ак­тивации и рекрутировании других субпопуляций иммунных клеток, а также в активации и повреж­дении эндотелиоцитов [15, 19, 22]. Последние че­рез различные механизмы сами могут иницииро­вать и поддерживать аллоиммунное повреждение трансплантата [23, 24], а также способствовать развитию аутоиммунных реакций [25-27]. По­добные эндотелиально-лейкоцитарные взаимо­действия могут протекать как в клубочках, так и в тубулоинтерстициальном компартменте почки, на что косвенно указывают выявленные корреляции количества иммунных клеток в клубочках и интерстиции.

Вместе с тем, известна роль определенных субпопуляций моноцитарно-макрофагальных клеток (CD68+CD206+) в развитии фибропласти­ческих изменений, как исхода хронического по­вреждения любого генеза [28, 29], а значительная инфильтрация, в том числе в зоне фиброза, указы­вает на текущее активное повреждение [29, 30].

В значительной части случаев (60 %) были также выявлены В-лимфоцитарные инфильтра­ты различного размера от единичных CD20+ клеток до значительных агрегатов с формирова­нием образований, напоминающих третичные лимфоидные структуры (см. рис. 2). В данном исследовании было установлено, что такие ин­фильтраты в интерстиции при гломерулите явля­ются независимым предиктором потери АП. В ранее произведенных исследованиях в отноше­нии связи В-клеток в интерстиции с прогнозом получены различные данные: отсутствие влия­ния на выживаемость АП [31, 32], ассоциация с ее снижением [33, 34] или даже улучшение про­гноза при увеличении выраженности инфиль­трации интерстиция CD20+ клетками [35]. Такие противоречия могут быть отчасти объяснены гетерогенностью исследуемых групп и методик определения степени инфильтрации. Кроме того, субпопуляционный состав В-лимфоцитарных CD20+ инфильтратов может быть представлен эффекторными и регуляторными клетками [36­38]. Известно, что В-клетки способны принимать участие в Т-клеточном отторжении через непо­средственную активацию Т-лимфоцитов [39] и в антительно-опосредованном отторжении через дифференцировку в плазматические клетки [40].

Нодулярные лимфоидные структуры, по­добные обнаруженным в данном исследовании, могут быть выявлены при различных заболева­ниях и представляют собой, как полагают, реак­цию иммунной системы на хроническую анти­генную стимуляцию [41, 42]. Можно предполо­жить, что в таких случаях происходит локальный В-клеточный иммунный ответ с синтезом антител к антигенам АП и адсорбцией их в трансплантате при минимальных попаданиях в системную цир­куляцию [41-45]. Существование в третичных лимфоидных структурах локального гуморально­го иммунитета, отличающегося от системного по специфичности и репертуару антител, показано при хроническом отторжении аллографта и забо­леваниях аутоиммунного генеза [41, 42, 46].

К ограничениям данного исследования можно отнести определение только анти-HLA-ДСА, от­сутствие последующих ИГХ исследований биоптатов для оценки динамики, отсутствие дифференци­рованного подсчета уровней инфильтрации микро­сосудов интерстиция и собственно интерстиция, а также ретроспективный характер исследования и отсутствие контрольной группы. Вместе с тем, к преимуществам исследования можно отнести ко­личество случаев и их селекцию по наличию гло- мерулита, а также длительный период наблюдения с оценкой твердых конечных точек прогноза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выраженность инфильтрации интерстиция CD3+, CD68+ и CD20+ клетками при гломерулите может быть предиктором прогноза выживаемости АП.