ОЦЕНКА СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА И ФАКТОРОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ГИПЕРКОАГУЛЯЦИЕЙ, У МУЖЧИН С МЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ И НАЧАЛЬНЫМ СНИЖЕНИЕМ СКОРОСТИ КЛУБОЧКОВОЙ ФИЛЬТРАЦИИ

ВВЕДЕНИЕ

Взаимосвязь компонентов метаболического синдрома (МС) с риском тромботических ослож­нений не вызывает сомнений [1-3]. С одной сто­роны, его составляющие способствуют развитию изменений в системе гемостаза, с другой - ряд факторов гиперкоагуляции ассоциированы с про­грессирующей дисфункцией почек, нередко на­блюдаемой у этих пациентов [4, 5]. Важную роль также играют гендерные особенности метаболи­ческих нарушений и изменений системы гемоста­за при сниженной скорости клубочковой фильтра­ции. В ряде исследований были выявлены кор­реляционные связи между гемодинамическими, метаболическими, гормональными факторами и активацией тромбообразования у мужчин с МС и нарушенной функцией почек [3, 7, 8]. Изменения в системе гемостаза являются одним из наиболее значимых звеньев в патогенезе сосудистых ката­строф, однако влияние отдельных составляющих МС, в частности, ранних изменений в обмене углеводов, на тромбообразование у пациентов с начальным снижением почечной функции ис­следовано недостаточно. Целью настоящей рабо­ты являлось изучение факторов, ассоциирован­ных с гиперкоагуляцией, у мужчин с начальным снижением скорости клубочковой фильтрации (НССКФ) и МС в зависимости от наличия в его составе нарушений углеводного обмена.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 79 мужчин с НССКФ и МС. МС диагностировался в соответ­ствии с критериями Международной федерации диабета (2009) [9]. Критериями исключения были тяжелые соматические заболевания - печеночная, сердечная, дыхательная недостаточность, указа­ния на наличие в анамнезе острого нарушения мозгового кровообращения, инфаркта миокарда, онкологических заболеваний, сахарного диабета по критериям ВОЗ, нарушения функции щито­видной железы, первичная семейная гиперхолестеринемия, симптоматические артериальные гипертензии, первичные нефропатии, пациенты, получающие одну из групп лекарственных препа­ратов: статины, сахароснижающие препараты, антиагреганты, антикоагулянты, ингибиторы АПФ, блокаторы рецепторов ангиотензина II.

Пациенты были разделены на 2 группы: основ­ная - больные с НССКФ и МС с изменениями в углеводном обмене (гиперинсулинемия, инсулинорезистентность, нарушение гликемии натощак, нарушение толерантности к углеводам) (n=44) и группа сравнения - больные с НССКФ и МС без нарушений углеводного обмена (n=35). Клиниче­ские характеристики пациентов представлены в табл. 1.

У всех больных методом иммуноферментно- го анализа определяли суточную экскрецию аль­бумина с мочой, оценивали уровень креатинина в крови. СКФ рассчитывали по формуле CKD- EPI. Степень снижения СКФ определяли в соот­ветствии с Национальными рекомендациями по хронической болезни почек (ХБП) [4]. Уровень глюкозы в крови натощак и через 2 ч после еды (постпрандиальная гликемия) определяли глюкозооксидазным методом. Сывороточные концен­трации С-пептида (референсные значения - 0,3­1,3 пмоль/л) и инсулина (3-25 мМЕ/л) оценивали строго натощак. Исследования проводили на иммунохемилюминисцентном анализаторе «Инте­гра» фирмы «Roche» (Швейцария). Для опреде­ления инсулинорезистентности был использо­ван расчетный метод оценки гомеостатического индекса инсулинорезистентности (НОМА-IR). НОМА-IR = (инсулин натощак мМЕ/л*глюкоза натощак ммоль/л)/22,5). Нормальным считали НОМА-Ш<2,0. Методом ИФА определяли уров­ни гликированного гемоглобина (4-6,0%), лепти- на (2-5,6 нг/мл) и адипонектина (4-16 мкг/мл). Уровень общего тестостерона (7-28 нмоль/л) оце­нивали с помощью стандартизованной методики прямого конкурентного иммунохемилюминес- центного анализа на автоматическом анализаторе «ACS-180» («Bayer», США). Клинический анализ крови выполнялся на гематологическом анали­заторе «Микрос 60 ОТ» (Франция). Количество активированных тромбоцитов (CD41+CD62P+) оценивалось методом проточной цитометрии на проточном цитофлуориметре «FACS Canto II» («Bacton Dickenson», США), референсные зна­чения - 4-10%. Всем пациентам была проведена интегральная оценка плазменного гемостаза ме­тодом тромбодинамики, который основан на ви­деомикроскопии фибринового сгустка, растуще­го от имитированной поврежденной сосудистой стенки. Оценивали следующие параметры: ско­рость роста сгустка (20-29 мкм/мин), задержка роста сгустка (0,6-1,5 мин), начальная скорость роста сгустка (38-56 мкм/мин), стационарная скорость роста сгустка (20-29 мкм/мин), размер сгустка через 30 мин (800-1200 мкм), плотность сгустка (15000-32000 усл.ед), появление спонтан­ных сгустков (в норме отсутствуют). Гомоцистеин определяли иммунохимическим методом (5­12 мкмоль/л), D-димер - при помощи латекс-теста (0-225 мг/мл), ингибитор активатора плазминоге- на (PAI-1) - с использованием микропланшетной методики (7-43 нг/мл).

Молекулярно-генетический анализ аллельных полиморфизмов, ассоциированных с нарушением обмена гомоцистеина, проводился методом поли­меразной цепной реакции в режиме «реального времени» с использованием стандартизованных комплектов реагентов для определения генетиче­ских полиморфизмов производства НПО «ДНК- технологии».

Статистический анализ данных проводили с применением пакета прикладных статистических программ «SPSS, ver. 20» (США) и программы «Microsoft Excel, ver. 14.0» (США). Результа­ты исследования представлены в виде средней арифметической±ошибка средней с указанием доверительного интервала при заданной вероят­ности. Межгрупповые различия по количествен­ным показателям оценивали с помощью критерия Манна-Уитни. Силу и направленность взаимос­вязи между признаками определяли путём вычис­ления коэффициента корреляции Спирмена (Rs). Критический уровень достоверности нулевой ста­тистической гипотезы принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Средние значения лабораторных показателей пациентов основной и контрольной групп пред­ставлены в табл. 2.

Пациенты основной и контрольной групп были сопоставимы по возрасту и функции почек, но при этом имели различные метаболические профили.

Определена высокая частота гипергомоцистеинемии (ГГЦ) у мужчин с МС. Так, из 79 об­следованных пациентов повышенный уровень го- моцистеина в крови выявляли у 82,3% (у 84,1% в основной группе и у 80,0% в группе сравнения). Значимых межгрупповых различий по уровню данной аминокислоты в плазме крови выявлено не было. 33 пациентам проведена генодиагности­ка полиморфизмов, ассоциированных с ГГЦ. У пациентов с МС генетические аномалии выявля­лись в 90% случаев (30 человек) в виде мутации генов метионин синтетазы редуктазы MTRR, по­лиморфизм A66G (гетерозиготное состояние - 16 человек, гомозиготное - 7), метионин синтетазы MTR, полиморфизм A2756G (гетерозиготное со­стояние - 14 человек, гомозиготное - 0), 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFR, поли­морфизм С677Т (гетерозиготное состояние - 14 человек, гомозиготное - 3), 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFR, полиморфизм А1298С (гетерозиготное состояние - 7 человек, гомозиготное - 3).

При метаболических нарушениях ГГЦ, обу­словленная наличием одной точечной мутации, встречалась в 23% случаев, сочетанием двух - в 43%, трех - в 17%, четырех - в 17%. При оценке уровня гомоцистеина в крови в зависимости от количества полиморфизмов значимых различий выявлено не было. В основной группе уровень гомоцистеина имел положительные корреляцион­ные связи средней силы с MCH (Rs=0,5; p<0,05) и плотностью сгустка (Rs=0,5; p<0,05).

При проведении интегральной оценки плаз­менного гемостаза у пациентов основной груп­пы выявлена более высокая плотность сгустка по сравнению с больными контрольной группы: 28 012±1013 и 25 209±1176 усл. ед., соответствен­но (р<0,05). Среди других параметров, ассоции­рованных с гиперкоагуляцией, оценивали уров­ни PAI-1, D-димера, количество активированных тромбоцитов (CD41+CD62P+). Статистически значимые различия выявлены по уровню PAI-1. У пациентов с нарушениями углеводного обме­на: данный показатель был выше, чем у больных контрольной группы: 78,78±13,00 и 43,66±4,00 нг/ мл (р<0,01). В основной группе обнаружены по­ложительные корреляционные взаимосвязи сред­ней силы между количеством активированных тромбоцитов (CD41+CD62P+) и глюкозой плазмы крови натощак (Rs=0,4; p<0,05), количеством ак­тивированных тромбоцитов и постпрандиальной гликемией (Rs=0,5; p<0,05), PAI-1 и адипонекти- ном (Rs=0,4; p<0,05), PAI-1 и лептином (Rs=0,4; p<0,05). В группе мужчин с МС и НССКФ без на­рушений углеводного обмена обнаружены лишь симбатные зависимости PAI-1 с С-пептидом (Rs=0,4; p<0,05) и лептином (Rs=0,4; p<0,05).

При оценке параметров углеводного обмена выявлены закономерные межгрупповые различия (см. табл. 2).

В основной группе выявлены положительные корреляционные связи между глюкозой крови на­тощак и лептином (Rs=0,4; p<0,05), инсулином и лептином (Rs=0,4; p<0,05), инсулином и PAI-1 (Rs=0,4; p<0,05), отрицательные - между глюко­зой крови натощак и адипонектином (Rs=-0,4; p<0,05). В группе мужчин с МС и НССКФ без нарушений углеводного обмена наблюдались по­ложительные связи между инсулином и лептином (Rs=0,5; p<0,05), инсулином и количеством эри­троцитов в крови (Rs=0,6; p<0,05), С-пептидом и лептином (Rs=0,4; p<0,05), С-пептидом и количе­ством эритроцитов (Rs=0,7; p<0,05), С-пептидом и PAI-1 (Rs=0,4; p<0,05); отрицательная корреля­ционная связь - между инсулином и задержкой скорости сгустка (Rs=-0,4; p<0,05).

При оценке уровней адипокинов выявлены статистически значимые межгрупповые различия. Концентрация лептина в основной группе была выше, чем в контрольной группе: 13,56±1,40 и 8,95±1,60 нг/мл соответственно (р<0,01). В основ­ной группе выявлена положительная корреляци­онная связь между адипонектином и плотностью сгустка (Rs=0,4; p<0,05). В контрольной группе уровень адипонектина положительно коррелиро­вал как с плотностью сгустка (Rs=0,6; p<0,05), так и с задержкой скорости сгустка (Rs=0,6; p<0,05).

Уровень общего тестостерона у пациентов с НССКФ и МС вне зависимости от наличия в его составе НУО был в пределах референтных значе­ний, однако в основной группе отмечаются досто­верно более низкие значения данного полового стероида по сравнению с пациентами контроль­ной группы: 11,54±0,70 и 14,50±1,10 нмоль/л со­ответственно (р<0,05). Вне зависимости от на­личия нарушений углеводного обмена у больных с МС при НССКФ выявляли одинаковой силы положительную корреляционную взаимосвязь между концентрацией общего тестостерона и стационарной скоростью роста сгустка (Rs=0,4; p<0,05).

В отношении показателей красной крови зна­чимых межгрупповых различий не обнаружено. В основной группе выявлена положительная кор­реляционная взаимосвязь между гемоглобином и скоростью роста сгустка (Rs=0,4; p<0,05). Также в этой группе наблюдалась положительная корреля­ция RDW с D-димером (Rs=0,4; p<0,05) и плотно­стью сгустка (Rs=0,6; p<0,05).

В группе мужчин с НССКФ и МС без наруше­ний углеводного обмена выявлена взаимосвязь гематокрита с появлением спонтанных сгуст­ков (Rs=0,5; p<0,05) и скоростью роста сгустка (Rs=0,5; p<0,05).

Значимых межгрупповых различий по уровню креатинина, СКФ и альбуминурии обнаружено не было, однако у мужчин с НССКФ и МС без на­рушений углеводного обмена концентрация креатинина положительно коррелировала с уровнями адипонектина (Rs=0,4; p<0,05) и гомоцистеина (Rs=0,4; p<0,05)

ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе проведенного исследования мы оцени­вали состояние гемостаза и влияние факторов, ассоциированных с протромбогенными измене­ниями, у мужчин с МС при НССКФ. Согласно результатам экспериментальных работ, гиперго- моцистеинемия в сочетании с метаболическими нарушениями вносит значительный вклад в раз­витие тромботических ангиопатий [5, 10]. Дан­ные мировой литературы и полученные нами данные указывают на высокую частоту наруше­ний обмена гомоцистеина при сочетании МС и НССКФ [11-13]. Это можно лишь отчасти связать со снижением почечного клиренса гомоцистеина, недостаточным поступлением и/или усвоением витаминов группы В, побочными эффектами ле­карственной терапии в условиях неизбежной полипрагмазии. Вероятно, более значимая роль в развитии ГГЦ принадлежит генетическим дефек­там в ферментативных системах, регулирующих метаболизм данной аминокислоты [14]. У боль­шинства обследованных пациентов с МС были выявлены полиморфизмы, ассоциированные с ГГЦ. Оценка их клинического значения требует проведения дальнейших целенаправленных ис­следований. При сравнении групп больных с раз­личным составом МС мы не выявили различий по уровню гомоцистеина, что указывает на от­сутствие взаимосвязи между степенью ГГЦ и на­личием патологии углеводного обмена при мета­болических нарушениях и согласуется с данными мировой литературы [15].

Тромбообразование представляет собой целый каскад процессов, на который влияет большое ко­личество факторов, включая состояние эндотелия и свойства эритроцитов [16, 17]. Не вызывает со­мнения повышенный риск тромбообразования в условиях ГГЦ [5, 10]. Данные мировой литерату­ры о влиянии ГГЦ на показатели красной крови и обмен железа неоднозначны. В основной группе нами выявлена положительная взаимосвязь меж­ду уровнем гомоцистеина и средним содержанием гемоглобина в эритроците (МСН). Из данных ли­тературы известно о положительной корреляции между уровнями сывороточного железа и гомоци- стеина, а также между гомоцистеином и феррити- ном плазмы крови как у здоровых мужчин, так и у мужчин с инфарктом миокарда [18]. Более того, J.E. Baggott и T. Tamura (2015) установили возмож­ность железозависимой конверсии аденозилгомоцистеина, цистатионина (in vitro) и метионина (in vivo) в гомоцистеин [19]. С другой стороны - экс­периментально установлено гемолитическое дей­ствие гомоцистеина. Механизмы, посредством которых осуществляется данный эффект, в на­стоящее время уточняются. Предполагается, что гемолиз может быть опосредован воздействием на N-метил-D-аспартатный рецептор эритроцитов (NMDAP). Исследования in vitro показывают, что вероятность гемолиза выше при сочетании дефи­цита витамина В₁₂ и высокого уровня гомоцистеина [20]. E. Zittan и соавт. (2007) установлено повы­шение риска развития В₁₂-дефицитной анемии у лиц с ГГЦ, обусловленной мутацией гена 5,10-ме- тилентетрагидрофолатредуктазы (полиморфизм С677Т, генотип ТТ) [21]. Также в качестве одного из потенциальных механизмов рассматриваются окисление сульфгидрильной группы гемоглобина и возникновение его внутриэритроцитарной пре­ципитации [20].

В нашем исследовании у пациентов основной группы выявлена положительная корреляцион­ная взаимосвязь между уровнем гомоцистеина и плотностью фибринового сгустка. Неблагопри­ятные эффекты гомоцистеина при метаболиче­ских нарушениях опосредуются через различные факторы гиперкоагуляции [5, 22]. Данные миро­вой литературы указывают на значительное уве­личение уровня фибриногена, числа тромбоцитов и высвобождаемых ими прокоагулянтных микро­частиц в ответ на введение гомоцистеина [23-26], однако результаты исследований в отношении по­казателей тромбодинамики при ГГЦ спорны. По данным R. Marchi и соавт., уровень гомоцистеина в крови не оказывает значимого влияния на по­казатели тромбодинамики [27]. При проведении масс-спектрометрического анализа фибриногена установлена возможность его гомоцистеинили- рования, что ассоциировано с модификацией α С-домена, нарушениями латеральной ассоциации волокон и связывания с кальцием, приводящими к повреждению структуры фибринового сгустка. Более того, гомоцистеинилирование фибрино­гена за счет влияния на активность и процессы связывания с фибринолитическими фермента­ми приводят к увеличению резистености к фибринолизу [23, 28]. Также в литературе описана гомоцистеин-опосредованная активация прокоагулянтного потенциала красных клеток крови по­средством высвобождения микрочастиц [26]. Вы­явленная вышеописанная корреляция в основной группе представляет интерес в плане дальнейше­го изучения изменений показателей тромбодина- мики в условиях комплексного воздействия ГГЦ и гипергликемии различной степени выражен­ности. Анализ уровней PAI-1 показал достовер­но более высокие значения в основной группе. С одной стороны, повышение PAI-1, вероятно, указывает на выраженность функциональной не­состоятельности эндотелия и протромботическую направленность у этих пациентов. Исследования показывают, что эндотелиальная дисфункция со­провождается функциональным угасанием, апоптозом, десквамацией клеток эндотелия, угнете­нием их регенерации с последующим усилением локальной экспрессии цитокинов и привлечением моноцитов в субэндотелиальное пространство, стимулированием высвобождения прокоагулян­тов, в конечном итоге приводящими к интрагло- мерулярной гипертензии, повышению проницае­мости гломерулярной базальной мембраны и фор­мированию тромботических микроангиопатий [5, 29]. С другой стороны - увеличение PAI-1 у па­циентов с НССКФ, МС и НУО можно объяснить более выраженной активацией системы ренин- ангиотензин-альдостерон. Данные факторы в со­вокупности оказывают значимую роль в форми­ровании фиброзирования и склерозирования по­чечной ткани [5].

В нашем исследовании у пациентов вне зави­симости от наличия нарушений углеводного об­мена в составе МС при НССКФ выявлены поло­жительные корреляционные взаимосвязи между уровнем инсулина натощак, лептином и PAI-1, что согласуется с данными литературы [1, 29].

Неоднозначны данные о взаимодействиях адипонектина и PAI-1. По нашим данным, у пациен­тов основной группы выявлена положительная корреляция между этими показателями. Более того, вне зависимости от наличия у пациентов на­рушений углеводного обмена в составе МС уста­новлена прямая зависимость между данным адипокином и плотностью фибринового сгустка. Од­нако при этом в группе сравнения уровень адипонектина положительно коррелировал с задержкой скорости роста сгустка. Общеизвестной является роль гипоадипонектинемии в формировании ме­таболических нарушений и сердечно-сосудистых поражений, ассоциированых с гиперкоагуляцией [2]. Однако в последние годы была также показа­на взаимосвязь между адипонектином, в частно­сти, его высокомолекулярной формой и ренальной дисфункцией, анемией, гиперкоагуляцией при СД 2-го типа [30]. Выявленные нами положительные корреляции между адипонектином и креатинином, гликированным гемоглобином в группе срав­нения также подтверждают ассоциацию данного адипокина с нарушением функции почек при МС. Другие работы указывают на значимость анемии и отсутствие связи с нарушением почечной функ­ции в формировании гиперадипонектинемии у этих пациентов [31]. Также описано повышение уровня высокомолекулярного адипонектина при СД 2-го типа и сердечно-сосудистых заболевани­ях [25]. В связи с неоднозначностью роли адипо- нектина у пациентов с различными компонента­ми МС требуются дальнейшие исследования для уточнения условий и механизмов реализации его действия.

У пациентов основной группы выявлена по­ложительная корреляционная взаимосвязь уров­ня гликемии натощак и после еды с количеством активированных тромбоцитов (CD41+CD62P+). Данное обстоятельство, вероятно, связано с дис­балансом тромбоксансинтезирующей системы тромбоцитов и активацией тромбоцитагрегирующих агентов вследствие гипергликемии [32].

У мужчин с НССКФ и нарушениями угле­водного обмена в составе МС диагностирован достоверно более низкий уровень общего тесто­стерона по сравнению с пациентами без данных нарушений, что, вероятно, связано с изменениями метаболизма гормона вследствие формирования первичной недостаточности клеток Лейдига и гипоталамо-гипофизарной регуляции тестикуляр­ного стероидогенеза, нарушениями перифериче­ского метаболизма данного полового стероида и функционирования систем гипофиз-кора надпо­чечников, дофамин-пролактин, соматотропный гормон-ИФР-1 [33, 34]. Роль половых стероидов в патологии гемостаза у пациентов с МС и снижен­ной почечной функцией остается неоднозначной. С одной стороны, ряд работ указывают на то, что более низкие уровни тестостерона у мужчин при ХБП и МС ассоциированы с более высокой смер­тностью, однако от заместительной гормональной терапии половыми стероидами у этих пациентов рекомендуется воздержаться в связи с отсутстви­ем ожидаемых положительных результатов [7, 33, 35]. С другой стороны - общеизвестным являет­ся вклад андрогенов в развитие гиперкоагуляции [36]. Полученная нами положительная корреля­ция между общим тестостероном и стационар­ной скоростью роста сгустка также указывает на взаимодействие системы свертывания крови и половых стероидов у пациентов с МС и НССКФ. Однако ряд исследований исключают связь высо­кого уровня эндогенного тестостерона с тромбофилией [37]. Неоднозначность данных о влиянии андрогенного статуса и системы гемостаза у муж­чин с МС и НССКФ требует дальнейших иссле­дований.

В основной группе выявлены положительная корреляционная связь между уровнем глюкозы натощак и лептином и отрицательная - между гли­кемией натощак и адипонектином, что указывает на непосредственную взаимосвязь обмена углево­дов и липидов при метаболических нарушениях. Более того, у пациентов при МС вне зависимости от наличия в его составе патологии углеводного обмена уровень инсулина положительно коррели­рует с уровнем лептина, что согласуется с данны­ми литературы.

Выявленные нами положительные корреляции в основной группе между гемоглобином и скоро­стью роста сгустка, в группе сравнения - между гематокритом и появлением спонтанных сгуст­ков, скоростью роста сгустка указывают на не­посредственное участие красных клеток крови в гемостазе. Также у мужчин с НССКФ и МС без нарушений углеводного обмена обнаружены по­ложительные корреляции количества эритроци­тов с инсулином и С-пептидом в сыворотке кро­ви, что представляет интерес в плане изучения механизмов формирования эритроцитоза и его прокоагулянтного потенциала у больных с МС. Отсутствие подобной зависимости у пациентов основной группы, вероятно, свидетельствует об активизации в условиях гипергликемии различ­ных механизмов глюкозотоксично сти и других неблагоприятных влияний на эритропоэз, кото­рые по своей силе превосходят обнаруженные в группе сравнения взаимосвязи [38, 39].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, у мужчин с МС и НССКФ определена высокая частота выявления ГГЦ, ко­торая в 90% случаев ассоциирована с наличием генетических дефектов в ферментативных систе­мах, регулирующих обмен данной аминокислоты. Степень ГГЦ у этих пациентов не зависит от на­личия нарушений углеводного обмена в составе МС. Нарушения углеводного обмена при МС и начальном снижении почечной функции ассоции­рованы с прокоагулянтным статусом посредством повышения PAI-1, влияния на процессы формиро­вания фибринового сгустка, многочисленных по­тенцирующих тромбообразование взаимосвязей между метаболическими и гематологическими показателями и факторами, регулирующими ге­мостаз. Роль адипонектина в развитии гиперкоа­гуляции остается не вполне ясной и требует уточ­нения. Дальнейшее изучение клинического зна­чения выявленных факторов, ассоциированных с гиперкоагуляцией у больных с МС и НССКФ, должно способствовать индивидуализации и по­вышению эффективности профилактики тромбообразования и сердечно-сосудистых событий у этих пациентов.

Работа выполнена при поддержке гранта Прези­дента РФ для государственной поддержки молодых российских ученых МК-5632.2015.7.