РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ КОНЦЕНТРАЦИИ ЭЛЕКТРОЛИТОВ В АМНИОТИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ КРОЛЬЧИХ НА СРОКЕ 27–28 СУТ БЕРЕМЕННОСТИ

ВВЕДЕНИЕ

В физиологической регуляции объема амнио­тической жидкости (АЖ) и ее состава многое остается неясным, что связано с двумя фактора­ми: 1) существует восемь потенциальных путей формирования и оттока АЖ (моча плода, интрамембранный путь, заглатывание, секрет легких, секрет носоглотки, трансмембранный и чрескож­ный пути, а также перенос через поверхность пуповины); 2) скорость перехода воды и раство­ренных веществ через большинство из этих путей редко измеряется одновременно [1]. Без знания нормальных значений концентрации ионов в АЖ, ее объема и осмоляльности у животных невоз­можно создание модели для изучения патологии регуляции объема АЖ и фармакокинетики лекар­ственных препаратов на поздних сроках беремен­ности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на первобеременных крольчихах (n = 6) массой 4-5 кг на сроке беремен­ности 27-28 сут (при нормальной длительности беременности у кроликов 31 сут). Оплодотворение проводили разными случайно выбранными самца­ми, после чего крольчихи находились в одиночных клетках на свободном питании. На 27-28-е сутки беременности животных умерщвляли методом цервикальной дислокации и через 15 мин прово­дили срединную лапаротомию и удаляли матку. Из полости матки высекали и извлекали амниотиче­ские мешки с плодами (n = 75) и разделяли мате­ринскую и плодную части плаценты, не нарушая целостности амниотического мешка. Одноразо­вым шприцем из амниотического мешка извлекал­ся весь доступный объем амниотической жидко­сти. Измерялись масса плода, плодной части пла­центы и общий объем амниотической жидкости.

Критериями включения крольчих в исследова­ние были: 1) срок беременности 27-28 сут; 2) мас­са беременных крольчих 4-5 кг. Критериями ис­ключения плодов из исследования были: 1) масса плода менее 20 г; 2) объем амниотической жидко­сти в амниотическом мешке менее 50 мкл; 3) на­личие в амниотической жидкости визуально вы­являемой крови (табл. 1). Общая характеристика плодов представлена в табл. 2. Как видно из пред­ставленных данных, только в двух третях наблю­дений удалось получить достаточный для иссле­дования объем амниотической жидкости пригод­ного для исследования качества.

Образцы амниотической жидкости центрифу­гировали в течение 15 мин при 1200 g, заморажи­вали и хранили при температуре -20 °С не более одного месяца до проведения биохимического ис­следования. В образцах амниотической жидкости определяли концентрации ионов Na+, K+, Cl^-, не­органического фосфата (P.) и Ca²+, а также осмо- ляльность амниотической жидкости.

Концентрации ионов Na⁺, K⁺ и Cl^- определяли потенциометрическим методом на автоматическом биохимическом анализаторе «Dimension Xpand» («Siemens», Германия) с использованием моду­ля «QuikLyte Integrate Multisensor» («Siemens», США). Общую концентрацию ионов Ca²+ опреде­ляли колориметрическим методом набором реа­гентов «CA Calcium Flex reagent cartridge» (кат. № EA4164) («Siemens», США) на автоматическом биохимическом анализаторе «Dimension Xpand» («Siemens», Германия). Концентрацию P_i, который при физиологических значениях pH представляет собой смесь ионов HPO₄^2- и H₂PO₄^-, определяли колориметрическим методом набором реагентов «PHOS Phosphorus Flex reagent cartridge» (кат. № EA 4172) («Siemens», США) на автоматическом биохимическом анализаторе «Dimension Xpand» («Siemens», Германия). Осмоляльность амнио­тической жидкости определяли по принципу из­мерения давления паров при помощи осмометра «Vapro» («Wescor», США).

Статистический анализ данных проводили с использованием пакета прикладлынх статистиче­ских программ JMP 7.0 (SAS Institute, США). Рас­считывали среднее, стандартное квадратическое отклонение, ошибку среднего, нормальность рас­пределения по критерию Шапиро - Уилка). Вы­полняли множественный корреляционный анализ с использованием коэффициента Пирсона при нормальном распределении или по коэффициен­та Спирмена - при ненормальном распределении. Для определения референтных величин концен­траций компонентов амниотической жидкости рассчитывали 2,5-й и 97,5-й процентили [2]. Ну­левую статистическую гипотезу об отсутствии различий и связей отвергали при p<0,05.

Настоящая работа одобрена локальным эти­ческим комитетом ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты исследования объема АЖ, а также концентрации ионов в АЖ и ее осмоляльности представлены в табл. 3. Из исследованных неор­ганических ионов в АЖ максимальная концентра­ция регистрировалась у ионов Na+ и Cl^-, а мини­мальная - у ионов P_i и Ca²+.

Объем амниотической жидкости обратно кор­релировал с массой плода (г = -0,525, p < 0,001), что подтверждает многочисленные свидетельства уменьшения объема АЖ перед родами [3]. На ак­тивацию процессов сохранения воды перед рода­ми также указывает корреляция осмоляльности АЖ с массой плода (г = 0,375, p = 0,022).

Концентрация ионов Na+, K+, Cl^-, но не ионов Ca²+ или P_i. коррелировала с массой плаценты (г = 0,368, p = 0,025; г = 0,353, p = 0,032; г = 0,381, p = 0,020; г = -0,003, p = 0,987 и г = 0,079, p = 0,642 соответственно), что свидетельствует о важ­ности ее нормальной функции в переносе ионов Na⁺, K⁺, Cl^- для водно-солевого баланса плода, а отсутствие корреляционной связи между массой плаценты и концентрациями ионов Ca²⁺ или P_i в АЖ указывает на большее значение плода в регу­ляции экскреции этих ионов.

Осмоляльность АЖ в значительной степени определялась концентрациями ионов Na+ и Cl^- и в меньшей степени концентрацией ионов K+. На это указывает мощная корреляционная связь между осмоляльностью АЖ и концентрациями ионов Na⁺ и Cl^- и менее значимая связь осмоляльности с концентрацией ионов K+: г = 0,514, p < 0,001, г = 0,510, p < 0,001 и г = 0,316, p = 0,057 соответ­ственно.

ОБСУЖДЕНИЕ

АЖ отражает гомеостаз как плодов, так и мате­ринского организма [4-6]. Определение нормаль­ных биохимических параметров АЖ необходимо для изучения регуляции ее ионного состава, объ­ема и механизма образования, что позволит раз­работать действующую модель для исследования фармакокинетики лекарственных препаратов в беременных организмах.

В регуляции объема и состава АЖ участвуют несколько механизмов: диурез плода, интрамем- бранный путь, заглатывание, секреция легкими и носоглоткой, трансмембранный путь, чрескож­ный путь и всасывание через эпителий пуповины [1]. Следует учитывать, что в конце беременно­сти, когда проводилось исследование, кожа плода кератинизирована [1], вследствие чего чрескож­ный и пуповинный путь возможно не учитывать. Оставшиеся шесть путей можно разделить на пути формирования (моча плода, секрет легких и секрет носоглотки), ведущие к увеличению объ­ема АЖ, и пути оттока (интрамембранный путь, заглатывание и трансмембранный путь), ведущие к его уменьшению.

Моча плода - основной путь формирования АЖ. Доказано, что объем АЖ и скорость тока мочи пло­да коррелируют друг с другом [7]. По-видимому, моча является источником для большинства ионов (Na+, K+, Cl^-, Ca²+ и P_i) АЖ, поскольку образует приблизительно три четверти ее объема [1].

Секрет легких - другой важный путь форми­рования АЖ. Его наличие доказывается наличием сурфактанта в АЖ в конце беременности [8]. Од­нако установить истинный вклад секрета легких затруднительно, так как его большая часть еще до выхода в АЖ заглатывается [9]. Объем секрета легких составляет около четверти всей произво­димой АЖ [1].

Секрет носоглотки также является путем фор­мирования АЖ, однако на практике отследить его динамику еще более затруднительно, так как вы­деления носоглотки проглатываются полностью, и отличить их от секрета легких можно только большим содержанием K⁺ и слизи [10].

Интрамембранное всасывание - переход воды и растворенных веществ через амнион в сосуды плода. Интрамембранный путь имеет два компо­нента: пассивный и активный [11]. Пассивный компонент - двунаправленный, постоянный и соответствует простой диффузии по градиенту концентрации. В обычных условиях пассивный компонент характеризуется притоком жидкости в плод и секрецией ионов Na⁺ и Cl^- из плода в АЖ [12]. Активный компонент является однонаправ­ленным и является основным путем оттока АЖ [13, 14]. Интрамембранное всасывание обеспечи­вает около двух третей оттока АЖ [1].

Заглатывание АЖ плодом также является зна­чимым путем удаления АЖ из амниотического мешка. Заглатывание обычно вызвано ответом плода на изменение объема АЖ, т.е. ответной ре­акцией ЦНС [15]. При увеличении объема АЖ объем заглатываемой АЖ также возрастает, а при маловодии - уменьшается [16]. Заглатывание обе­спечивает около трети оттока АЖ [1].

Трансмембранный путь в конце беременности представлен в небольшом объеме, однако важен в начале гестации, так как проницаемый хорион позволяет жидкости, вырабатываемой стенкой матки, проникнуть в плодное яйцо [1]. Увеличе­ние осмоляльности АЖ ведет к ее всасыванию в организм матери, но в небольших объемах, на­столько низких по сравнению с другими потока­ми, что этот путь в конце беременности возможно не учитывать.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Среди описанных путей образования и удале­ния АЖ перед родами наибольшее значение име­ет образование АЖ из компонентов мочи и секре­та легких плода, а удаление - с использованием интрамембранного пути оттока и заглатывания АЖ. Полученные результаты нормальных кон­центраций исследованных ионов в АЖ, а также ее объема и осмоляльности являются следствием функционирования представленных путей фор­мирования и оттока АЖ. Эти данные могут быть использованы для разработки животных моделей влияния лекарственных препаратов (в частности, диуретиков) на объем, осмоляльность и ионный состав АЖ на поздних сроках беременности.