Preview

Нефрология

Расширенный поиск

РЕГЕНЕРАТИВНЫЕ СТРАТЕГИИ РЕКОНСТРУИРОВАНИЯ ПОЧКИ

Полный текст:

Аннотация

Почка является важнейшим органом водного гомеостаза и экскреции токсических субстанций. Она выполняет несколько важных физиологических функций для обеспечения гомеостаза: удаляет циркулирующие продукты метаболизма, регулирует баланс жидкости в организме и действует как иммунный регулятор, а также модулятор нормального функционирования сердечно-сосудистой системы. В самое последнее время появились и активно развиваются модели почечных заболеваний in vitro с плюрипотентными стволовыми клетками (как стволовыми клетками человеческого эмбриона, так и индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками), а также разрабатываются надежные протоколы по получению in vitro клеток, подобных специфичным ренальным, из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациента. В данном обзоре мы приводим главные открытия в области регенерации почки с основным фокусом на развитие пошаговых протоколов по созданию почечных клеток из человеческих плюрипотентных стволовых клеток и самые последние достижения в области биоинжиниринга почки (т.е. децеллюляризированного почечного остова и биопринтинга). Возможность создания трехмерной структуры, подобной почке, с последующим наполнением ее индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками почечного происхождения может открыть новые перспективы для создания функционирующего по требованию почечного трансплантата.

Статья переведена на русский язык и опубликована согласно условиям лицензии Creative Commons. Журнал FEBS J. 2016 Sep;283(18):3303–24. doi: 10.1111/febs.13704. Перевод М.С.Храбровой. Редакция перевода И.И.Трофименко

Для цитирования:


Монтсеррат Н., Гаррета Е., Бельмонте Х. РЕГЕНЕРАТИВНЫЕ СТРАТЕГИИ РЕКОНСТРУИРОВАНИЯ ПОЧКИ. Нефрология. 2016;20(6):10-25.

For citation:


Montserrat N., Garreta E., Belmonte J. REGENERATIVE STRATEGIES FOR KIDNEY ENGINEERING. Nephrology (Saint-Petersburg). 2016;20(6):10-25. (In Russ.)

ВВЕДЕНИЕ

Болезни почек представляют собой одну из основных проблем здравоохранения в современ­ном обществе. Хроническая болезнь почек (ХБП) является ведущей причиной смертности и заболе­ваемости в западных странах, где её распростра­ненность составляет до 11% взрослого населения. ХБП может прогрессировать до неизлечимой стадии терминальной почечной недостаточно­сти (ТПН), требующей проведения диализа или трансплантации почки, что предпочтительно. К слову, затраты только на диализ составляют около 2% от национальных бюджетов здравоохранения, и в течение нескольких лет этот параметр удвоит­ся. Если эта тенденция продолжится, националь­ные правительства будут вынуждены тратить от 3 до 5% своего годового бюджета здравоохранения на заместительную почечную терапию, без учета огромной стоимости дополнительных медицин­ских расходов.

В настоящее время в США 122 403 человека ожидают жизнесохраняющую органную транс­плантацию, из которых 101 189 ожидают транс­плантацию почки [1, 2]. Среднее время ожидания первого почечного трансплантата составляет 3,6 года и может варьировать в зависимости от раз­личных параметров, таких как коморбидность, совместимость и доступность органа [2]. Заслу­живает внимания то, что в 2014 году в США было выполнено 17 105 трансплантаций почки. Из них 11 570 были трупные и 5535 - от живого донора [1, 2]. Отдел здравоохранения и служба обеспечения органами и планирования трансплантаций США установил, что более 3000 новых пациентов еже­месячно добавляются в лист ожидания почечного трансплантата, и что в 2014 году 4270 пациентов умерли, ожидая пересадку. Таким образом, суще­ствует серьезная потребность развития новых те­рапевтических стратегий, которые позволили бы преодолеть данные проблемы.

Прогресс, достигнутый за последнее время в методологических подходах, основанных на ство­ловых клетках и достижениях тканевого инжини­ринга, привел к появлению новой стратегии реге­неративной медицины с целью лечения болезней почек.

Во-первых, возможность имитировать важ­ные этапы развития почки в культивированной среде показывает, что при некоторых условиях человеческие плюрипотентные стволовые клет­ки (чПСК) могут дифференцироваться in vitro в основные типы почечных клеток, повреждаю­щихся при патологии почек (например, подоциты и тубулярные клетки, и др.) [3, 4]. Во-вторых, по­являющиеся технологии, включающие децеллюляризацию/рецеллюляризацию и биопринтинг, стали революционными в области тканевого ин­жиниринга, открывая возможность создания та­кого комплексного трехмерного (3D) органа, как почка [5, 6].

В данном обзоре мы освещаем текущие до­стижения в стратегии регенеративной медицины по воссозданию почечной функции с основным фокусом на (а) направленную дифференцировку чПСК в клетки, подобные почечным, которые можно использовать для инжиниринга почки и (б) применение децеллюляризации/рецеллюляризации и технологии биопринтинга. Видится, что все эти методики являются многообещающи­ми стратегиями тканевого конструирования для биоинжиниринга почки, и здесь мы обсуждаем основные проблемы будущего осуществления этих многообещающих технологий в клиниче­ской практике (рисунок).

ЛЕЧЕНИЕ СТВОЛОВЫМИ КЛЕТКАМИ ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ПОЧКИ: ПРОБЛЕМЫ И ТЕКУЩЕЕ ПОЛОЖЕНИЕ ДЕЛ

Болезни почек являются значимой проблемой здравоохранения во всем мире [7-9]. Распростра­ненность и плохой прогноз болезней почек и ассо­циированных патологий показывают срочную не­обходимость не только развития терапевтических подходов, но и расширения нашего понимания по­тенциала почки к развитию и восстановлению, о со- бенно, генерации нефрона, его дифференцировки и способности к самовосстановлению. Интерес­но, что почка взрослого млекопитающего имеет способность после повреждения восстанавливать некоторые типы клеток, включая клеточные эле­менты тубулярных и эпителиальных клеток, но не структуры клубочка [10-12]. Вероятно, это проис­ходит путем пролиферации резидентных клеток при отсутствии популяции предшественников или вновь сформировавшихся мультилинейных структур - процесс, называющийся «клеточной регенерацией» [13]. До сих пор клеточную реге­нерацию традиционно оценивают путем просле­живания точного клеточного происхождения этих пролиферирующих клеток [12-14], в то время как популяция клеток-предшественников может быть идентифицирована по способности предполагае­мых клеток-кандидатов дифференцироваться во многих направлениях [15].

В отличие от других организмов, таких как аквариумная рыбка Данио рерио и насекомые, у которых формирование новых нефронов возника­ет за счет регенерации поврежденных, у млекопи­тающих формирование новых нефронов ограни­чено эмбриогенезом и заканчивается к моменту рождения [16].

 

Рисунок. Применение ПСК (как ЭСК, так и иПСК) открывает перспективы для точной оценки необходимых условий, обеспечивающих суще­ствование почечных клеток взрос­лого для клеточной терапии. Также биоинжиниринг почки преследует цель использовать почечный остов как биологическую основу для дальнейшей рецеллюляризации, а появление биопринтинга в послед­нее время обеспечило реализацию главной стратегии по созданию орган-подобных структур в трех­мерном разрешении.

ПСК - плюрипотентная стволовая клетка; ЭСК - эмбриональная ство­ловая клетка; иПСК - индуциро­ванная плюрипотентная стволовая клетка.

 

ПЛЮРИПОТЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ (ПСК): ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ ИСТОЧНИК ДЛЯ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ

Уже в 1998 году было продемонстрировано, что плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) могут происходить из внутренней клеточной массы бла­стоциста эмбриона, превращаясь в эмбриональ­ную стволовую клетку (ЭСК) [17]. Человеческие ЭСК (чЭСК) стали новым объектом для изучения тканевого развития и моделирования заболеваний in vitro. С этого момента интенсивные исследова­ния были посвящены разработке надежного про­токола по дифференцировке чПСК с целью соз­дания функционирующих клеток, способных вос­станавливать утраченную в результате прогресси­рования дегенеративных болезней функцию. Тем не менее, молекулярные механизмы, вовлеченные в ограничение линий дифференцировки чПСК при формирования специализированных типов клеток, до сих пор находятся на стадии исследова­ния. Важно, что самым критичным препятствием для использования чПСК в клинической практике являются потребность в человеческих эмбрионах, что затрагивает этические вопросы, и отторжение тканей после трансплантации.

Существуют другие методы создания ПСК (чПСК) из соматических донорских клеток. Они включают различные способы клеточного репро­граммирования, в том числе перенос ядра сома­тической клетки в энуклеированную яйцеклетку [18], слияние с ПСК [19], воздействие низкомо­лекулярных химических веществ [20] и транс - дукция факторов репрограммирования [21]. В случаях переноса ядра соматической клетки и репрограммирования, опосредованного слияни­ем клеток, ядра соматических клеток помещают в тотипотентное или плюрипотентное окружение, соответственно [22].

С другой стороны - трансдукция факторов репрограммирования POU5F1 (POU домен класс 5 фактор транскрипции 1; также известный как октамер-связывающий протеин 3 или октамерсвязывающий протеин 4, ОСТ3/4), SRY (sex de­termining region Y, определяющий пол, регион хромосомы Y), box 2 (SOX2), Круппель (Kruppel) - подобный фактор 4 (KLF4) и онкоген миелоци- томатоза (c-MYC) [вместе относящиеся к OSKM (по первым буквам в названии факторов) или факторам Яманака] приводит к генерации ауто­совместимых индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК), которые совмещают потенциальные способности к самовосстановле­нию и дифференцировке при сравнении с чЭСК. Большинство первоначальных исследований по созданию иПСК пациента были основаны на ис­пользовании интегративных систем, чрезмерно экспрессирующих c-MYC и KLF4, два хорошо из­вестных онкогена [23, 24].

Для решения этих проблем разные лаборато­рии, включая нашу, проводили поиски различ­ных типов клеток, которые могли бы быть репро- граммированы при отсутствии двух онкогенных факторов, но при использовании преимуществ внутренних свойств выбранных донорских кле­ток (например, клетки, экспрессирующие отно­сительно высокий уровень любого из факторов Яманака, могут быть репрограммированы при от­сутствии этих специальных генов, так, например, невральные стволовые клетки при отсутствии SOX2). Исходя из этого, иПСК были успешно ге­нерированы при отсутствии KLF4 и/или c-MYC из кератиноцитов [24], стволовых клеток пупо­вины [25] и даже невральных стволовых клеток [26]. Хотя эти открытия показали возможность сокращения числа факторов для генерации иПСК, они по-прежнему были основаны на примене­нии интегративных систем, приводящих к не­желательным эффектам, касающимся случайной трансгенной инсерции (например, риск трансген­ной индукции после дифференцировки, неполное репрограммирование и др.). Очень быстро разные лаборатории по всему миру разработали новые методы для создания свободных от трансгенов иПСК [27-32], также внесли важные изменения в клеточные культуры (например матрицы/среды) для получения фидер-независимых человеческих иПСК (чиПСК) [33-35] и идентифицировали рас­творимые вещества, замещающие факторы Яманака для создания иПСК [20].

Вместе с этими важными трудностями в об­ласти получения иПСК были опубликованы ре­зультаты интенсивных исследований по созданию специфичных для пациента иПСК с последующей дифференцировкой в определенные виды ткани, поврежденные в результате прогрессирования бо­лезни, обеспечивая уникальный сценарий для мо­делирования болезни [36-41] и даже для подбора специфичных для пациента лекарств [42, 43].

Еще одна область, привлекающая большой ин­терес, это коррекция генетических заболеваний в пациент-специфичных иПСК в аспекте персона­лизированной медицины.

ПСК могут быть источником для исправления генома, так как они могут быть подвержены об­ширному спектру манипуляций с тканевой куль­турой (например выбор лекарства и экспансия клонов) с сохранением их плюрипотентности и стабильности генома [44]. Разными исследова­тельскими группами продемонстрированы гене­рирование и коррекция пациент-специфичных чиПСК [38, 39, 45-49]. Эти исследования по­казали функциональную коррекцию болезнь- ассоциированного фенотипа при дифференциров- ке пациент-специфичных чиПСК и даже открыли перспективы для скрининга элементов, восста­навливающих фенотип болезни [49, 50] - дости­жение, которое, как представляется, является пер­вым применением потенциала чиПСК в регенера­тивной медицине и здравоохранении [51].

ГЕНЕРИРОВАНИЕ ПОЧЕЧНЫХ КЛЕТОК ИЗ ПСК: МЕТОДОЛОГИИ, ОСНОВАННЫЕ НА ПСК, МОДЕЛИРУЮТ РАЗВИТИЕ ПОЧКИ И ЕЁЗАБОЛЕВАНИЯ

Почка состоит из тысяч нефронов, образую­щихся в ходе развития в результате реципрокного индуктивного взаимодействия между двумя раз­ными клеточными типами: клетками метанефральной мезенхимы (ММ) и мочеточникового зачатка (МЗ) [16]. ММ дифференцируется в раз­личные типы эпителиальных клеток почки (от клубочка до сегмента собирательных трубочек), а МЗ генерирует систему чашечек.

За последние несколько декад во многих рабо­тах определены условия культивирования для изо­ляции и распространения in vitro этих клеточных популяций, правда, с ограниченным успехом (об­зор в [13, 14, 52]). Альтернативной методологией для создания неограниченного количества клеток почечного типа является дифференцировка ПСК. В последние несколько лет независимые исследо­вательские группы, включая нашу, впервые опи­сали возможность создания различных почечных популяций из ПСК. Song и соавт. были первыми, кто сообщил о получении предшественников по- доцитов из чиПСК, которые были функциональ­ными и эффективно интегрированы в ткань мы­шиного метанефрия. Однако вопрос о том, какие из эмбриональных клеток-предшественников в ходе развития эквивалентны иПСК-незрелым по- доцитам SongX остается открытым [3].

Позднее в 2013 г. S.I. Мае и соавт. впервые диф­ференцировали монослой чЭСК в промежуточ­ную мезодерму (ПМ), эмбриональную ткань, ко­торая дает происхождение как ММ, так и МЗ [53]. С этой целью авторы создали разные репортерные линии чиПСК, в которых GFP был направлен в ген OSR-1 (Odd-skipped related 1 - ген, транзиторно экспрессируемый в промежуточной мезодерме в ходе эмбриогенеза). При специальных условиях клеточной культуры иПСК, дифференцированные из ПМ, показали свойства других типов зрелых почечных клеток и ограниченных канальцевых структур. Интересно, что те же авторы доби­лись получения химически определенной среды для получения иПСК из ПМ и недавно описали идентификацию двух ретиноид-подобных моле­кул, индуцирующих образование ПМ из иПСК. Именно в этих опытах авторы продемонстриро­вали, что в результате полученные из ПМ иПСК проявляли способность дифференцироваться во множество типов почечных клеток, также образуя 3D-структуру, подобную почечным канальцам в образцах органных культур ex vivo [54].

Аналогично наша группа впервые сообщила о возможности создания предшественников МЗ из клеток ПМ из чПСК и чиПСК, полученных от пациентов с поликистозной болезнью почек. Спу­стя 4 дня предшественники МЗ экспрессировали HOXB7, RET и GFRA1 в большей степени, чем маркеры ММ. Более того, когда МЗ-подобные чиПСК- клетки были культивированы совместно с диссоциированными клетками мышиного метанефрия Е11-5, образованные клетки включа­лись только в цитокератин 8 позитивные (+) МЗ- подобные структуры, предполагая индукцию коммитированных ПМ клеток МЗ линии ex vivo [55].

С другой стороны - группа Little’a разработала протокол по созданию хорошо изученных пред­шественников почечных клеток как из чПСК, так и чиПСК в ПМ через заднюю первичную полоску, из которой ПМ образуется в ходе развития. Авто­ры использовали собственную линию чПСК для мониторирования экспрессии MIXL1 (гена, транзиторно экспрессируемого в первичной полоске в ходе эмбриогенеза) путем включения GFP в локус MIXL1. Группа Little’a создала два разных прото­кола: один - для одновременной генерации дери­ватов ММ и МЗ и другой - для МЗ-клеток только из ПСК. Примечательно, что в этой работе ис­пользовали повторную агрегацию проб для опре­деления потенциала дифференцировки почечно­подобных генерированных клеток, показывая, что повторно агрегированные дифференцированные ПСК могут одни организовать и генерировать нефрон-подобные структуры [56].

Ранее Lam и соавт. опубликовали быстрый и эффективный протокол дифференцировки для по­лучения PAX2+LHX1+ ПМ-клеток из чПСК, ко­торые спонтанно формировали каналец-подобные структуры. Интересно, что Lam удалось показать, что PAX2+LHX1+ ПМ-клетки из чПСК интегри­ровались в мышиную культуру метанефрия и дифференцировались в мультипотентные стволо­вые клетки-предшественники нефрона (СКПН) мезенхимы, экспрессируя маркеры SIX2, SALL1 и WT1 [57]. Таким же образом Taguchi и соавт. также показали, что возможно получать СКПН, которые обладают потенциалом реконструирова­ния 3D-нефрон-подобной структуры, содержащей как гломеруло-, так и тубуло-подобные структуры при совместном культивировании in vitro с эм­бриональным спинным мозгом из мышиных ЭСК и чиПСК [58]. В этой же работе Taguchi и соавт использовали модели мышиных линий in vivo и изучали разные стадии развития СКПН у мышей с геном-репортером OSR-1-GFP и выявили, что популяция OSR-1-GFP-Integrina+PDGFRa имеет самый высокий потенциал формирования нефро- нов in vitro. Таким образом, авторы пересмотре­ли пространственную и временную локализацию предшественников нефрона метанефрия in vivo, демонстрируя, что ПМ содержит, по крайней мере, две субпопуляции предшественников метанефрия - передний и задний домены, и что ПМ, расположенный сзади, дает рост линиям ММ [58]. Интересно, что эта последняя работа продемон­стрировала, в какой момент времени зарождаю­щаяся мезодерма становится ПМ и как она ста­новится специфичной для ММ- и МЗ-линий [58].

Интересно, что Imberti и соавт. получили по­чечные клетки-предшественники из чиПСК, сле­дуя двухэтапному протоколу, где сначала чиПСК подвергают воздействию ретиноевой кислотой, ингибиторами в RhpA и PI3K и активином А, ин­дуцируя развитие ПМ. Далее чиПСК, полученные из ПМ, в течение следующих 13 дней были под­вергнуты воздействию FGF2, BMP7 и глиального нейротрофического фактора (GDNF) для созда­ния чиПСК из ММ. Хотя другие авторы уже про­демонстрировали возможность генерации чПСК из ММ, в этой работе Imberti и соавт. впервые по­казали, что чиПСК - предшественники почечных клеток - надежно внедряются в поврежденные ка­нальцы, восстанавливая почечную функцию [59].

Недавно Morizane и соавт. показали возмож­ность развития СКПН из чПСК. Работа Morizane элегантно демонстрирует, что возможно воспро­извести ММ почку in vitro и генерировать SIX2+- SALL1+WT1+PAX2+ СКПН с 90% эффективно­стью через 9 дней. Более важно, что авторы дока­зали, что СКПН формируют почечный органоид как в 2D-, так и в 3D-образцах после 21-28 дней, содержащий эпителиальные нефрон-подобные структуры, экспрессирующие маркеры подоцитов (PODXL, NPHS1), проксимальных каналь­цев (CDH2, LTL), петли Генле (CDH1, UMOD) и дистальных канальцев (CDH1, BRN1), копи­руя развитие нефрона. Важно, что для изучения механизмов токсичности проксимальных и/или дистальных канальцев при воздействии на по­чечный органоид химических агентов, рутин­но применяемым на животных моделях in vivo, была использована система культуры органои­дов [60]. Подобным же образом Fredman и со­авт. показали, что почечные стволовые клетки, полученные из чПСК- сфероидов, легко могут произвести почечные органоиды, воспроизводя ткань-специфичную эпителиальную физиологию. В частности, авторы смогли выключить гены подокаликсина, PKD1 (полицистин-1) или PKD2 (полицистин-2) с помощью технологии коротких палиндромных повторов, регулярно расположен­ных группами (CRISPR)/CAS9 с направляющей РНК CRISPR/Cas9, впервые доказав осуществи­мость создания 3D-почечной структуры для моде­лирования болезней почек человека [61]. Совсем недавно Takasato и соавт. [62] сделали еще один шаг для создания почечного органоида, содержа­щего индивидуальные нефроны, далее разделяю­щиеся на дистальные и проксимальные канальцы, начальную петлю Генле и клубочки, содержащие подоциты с развивающимися ножковыми отрост­ками и проходящие васкуляризацию. Также как Freedman и соавт. [61], Takasato и соавт. показа­ли, что проксимальные канальцы аккумулирова­ли декстран и дифференцированно подвергались апоптозу в ответ на цисплатину [62].

Хотя эти работы показали возможность соз­дания различных почечных популяций из чПСК, они до сих пор различаются в отношении при­меняемых реагентов, их концентраций и време­ни выдерживания (табл. 1). Важно отметить, что разные данные по дифференцировке ПСК в клет­ки почечных линий демонстрируют, что мы еще далеки от выделения генов маркеров или поверх­ностных протеинов, определяющих разные ПМ популяции, выявленные у мышей [58].

ТЕХНОЛОГИИ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА

За последнее время появились как потенциаль­ные средства для редактирования генома в чиПСК пациента вместе с CRISPR/Cas9, разные плат­формы по редактированию гена для увеличения гомологичной рекомбинантной эффективности, в частности ДНК-нуклеазы (цинк-содержащие нуклеазы, TAL эффекторные нуклеазы и мегануклеазы) [44]. В общем, ДНК-нуклеазы и CRISPR/ Cas9-технологии позволяют выполнять различ­ные манипуляции с геномом сайт-специфичным способом, например, активацию /инактивацию гена, удаление последовательности, замену эле­ментов и хромосомную перестройку [44, 63]. В контексте моделирования заболеваний почек CRISPR/Cas9-технология была использована для получения 3D-почечных структур из чиПСК для выключения генов PKD1 (полицистин-1) и PKD2 (полицистин-2), приводя к возможности моделирования поликистозной болезни почек в 3D-образце, похожей на компартмент почечного эпителия [61].

Помимо огромного влияния на моделирование заболеваний человека платформ геномного редак­тирования, недавно исследованы другие аспекты, включая использование таких технологий для генерации ПСК репортерных клеточных линий [64-67]. Недавно группа Little’a разработала но­вый протокол по созданию самоорганизующихся почечных органоидов из чПСК, эквивалентных почкам человеческого плода в течение первого триместра гестации [62]. Эти результаты выяви­ли, что мы, с одной стороны, до сих пор далеки от развития зрелых почечных клеток, имеющих терапевтический потенциал, подразумевая, что новые стратегии должны быть приняты во вни­мание для развитяи зрелых почечных клеток для клинического применения (например, использо­вание кондиционированной культуры медии из почечных эмбриональных клеток, использова­ние систем реаггрегации совмещенных культур с клетками плода человека и пр.). С другой сторо­ны - профиль экспрессии мРНК в работе Little и соавт. происходит из различных клеточных типов, самоорганизующихся в почечную 3D-структуру, затрудняя анализ молекулярных путей, обеспечи­вающих почечную дифференцировку из различ­ных индивидуальных клеточных типов, состав­ляющих почечный органоид. С этой точки зрения технологии редактирования генома, в частности система CRISPR/Cas, могут помочь создать линии человеческих репортерных ПСК для детально­го выявления молекулярных сигналов почечной дифференцировки и, таким образом, пригодных для выявления зрелости генерированных клеток в сравнении с их двойниками in vitro из развиваю­щихся эмбрионов.

До сих пор почечные линии репортерных ПСК генерировали путем искусственной бактериаль­ной векторной хромосомы [53] и лентивируса [56]. Эти плодотворные исследования открыли пригодность линий репортерных клеток для иден­тификации и размножения требуемых типов по­чечных клеток (т.е. ПМ-клетки и клетки прими­тивной полоски) в ходе начала дифференцировки. Важно отметить, что группа Osafune сделала дальнейший шаг в применении OSR-1-GFP ген-репортерных клеточных линий и выявила два агониста рецепто­ра ретиноевой кислоты, а именно АМ580 и TTNPB, которые вместе с CHTR 99021 индуцировали дифференцировку ПМ- клеток путем активации экспрессии КМП4 [54]. Интересно, что новый метод дифференцировки, использующий малые составляющие, обеспечил менее доро­гой и более совместимый метод генера­ции ПМ-клеток по сравнению с методом применения фактора роста, описанный этой же группой ранее [53]. Поскольку идентификация и размножение ткань- специфичных почечных стволовых кле- ток/клеток-предшественников с нефрогенным потенциалом являются критич­ным шагом в развитии клеточной терапии для заболеваний почек, применение по­чечного репортера ПСК может привести к разработке условий клеточного культи­вирования для получения 3D-почечной структуры из чПСК.

 

Таблица 1

Последние литературные данные по ренальной дифференцировке из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Авторы и год

Происхождение плюрипо­тентных стволовых клеток

Протокол ренальной дифференци­ровки

 

 

 

Song etal. (2012) [3]

Человеческие иПСК (мезангиальные клетки)

Формирование тела эмбриоида (3 дня): 10 нг/мл-1 активин А; 15 нг/мл-1 ВМР7, 0,1 цм ретиноидной кислоты

Гломерулярные подоциты (по­следовательная культура, 8 дней): 10 нг/мл-1 активин А; 15 нг/мл-1 ВМР7, 0,1 цм ретиноид­ной кислоты

 

 

Narayanan et al. (2013) [4]

Человеческие эПСК

Клетки проксимальных канальцев (20 дней): 10 нг/мл-1 ВМР2; 2,5 нг/ мл-1 ВМР7; 10 нг/мл-1 активин А; 0,1 цмоль/мл-1 ретиноидной кислоты

 

 

 

Мае et al. (2013) [53]

Человеческие ЭСК (Н9, khES1 и khES3), человече­ские иПСК (201В6, 201В7, 253G1 и 253G4)

Мезендодерма (2 дня): 100 нг/мл-1 активин А; 3 цм CHIR99021, 10 цм Y27632

Ранний промежуточный ме­зодерм (8 дней): 100 нг/мл-1 ВМР7; 3 цм CHIR99021

Промежуточный мезодерм (7 дней): 10 нг/мл-1 TGFpi

 

Araoka et al. (2014) [54]

Человеческие ЭСК, челове­ческие иПСК (дермальные фибробласты)

Ранний промежуточный мезодерм (2 дня): 100 нг/мл-1 ВМР7; 3 цм CHIR99021: 1 цм 4-[(Е)-2-(5,6,7,8- тетраги дро-5,5,8,8-тетраметил-2- нафталенил)-1 -пропенил] бензойная кислота (ТТНПБ)

Промежуточный мезодерм (3 дня): 1 цм ТТНПБ

 

 

Xia et al. (2013) [55]

Человеческие иПСК (дер­мальные фибробласты)

Мезодермальные предшественники (2 дня): 30 нг/мл-1 ВМР4; 50 нг/мл-1 ФРФ2; 17,5 цг/мл-1 инсулин

Клетки, подобные предше­ственникам уретрального зачатка промежуточной мезодермы (2 дня): 0,1 цм рети­ноидной кислоты; 10 нг/мл-1 активин А; 100 нг/мл-1 ВМР2

 

 

Takasato et al. (2014) [56]

Человеческие ЭСК

Задняя примитивная полоска: (а) 2 дня, 30 нг/мл-1 ВМР4; 10 нг/мл-1 активин А; (б) 2 дня, 8 цм CHIR99021

Промежуточный мезодерм: (а) 4дня, 200 нг/мл-1 ФРФ9; 1 цг/мл-1 гепарин; (б) 10 дней, 200 нг/мл-1 ФРФ9; 1 цг/мл-1 гепарин

Предшественники метанефраль- ной мезенхимы и уретрального зачатка: (а) 11 дней, 200 нг/мл-1 ФРФ9; 50 нг/мл-1 ВМР7; 0,1 цм ретиноидной кислоты; 1 цг/мл-1 гепарин; (б) 6 дней, без факторов

 

Lam et al. (2013) [57]

Человеческие ЭСК; челове­ческие иПСК (дермальные фибробласты)

Мезендодермий (2 дня): 5 цм CHIR99021

Промежуточный мезодерм (4 дня): 100 нг/мл 1 ФРФ2;0,1 цм ретиноидной кислоты

Сар-мезенхима (3 дня): 100 нг/ мл 1 ФРФ9; 10 нг/мл-1 активин А

 

Taguchi et al. (2014) [58]

Мышиные и человеческие иПСК

ЕВ-формация (1 день): 0,5 нг/мл-1 ВМР4; 10 цм Y27632

Эпибласт (2 дня): 1 нг/мл-1 ак­тивин А; 20 нг/мл-1 ФРФ2

Задняя образующаяся мезодер- ма(бдней): 1 нг/мл-1 ВМР4; Юцм CHIR99021

Задняя, промежуточная, мезодер­ма (2 дня): 10 нг/мл 1 активин А; 3 нг/мл-1 ВМР4; 3 цм CHIR99021; 0,1 цм ретиноидной кислоты; 10 цм Y27632

Продолжение табл. 1

Эта таблица представляет обзор нескольких последних публикаций, в которых человеческие плюрипотентные клетки были дифференцированы в почечные клеточные линии. Де­тально перечислены факторы роста и цитокины, использованные в процессе дифференцировки.

 

НОВЫЕ СТРАТЕГИИ БИОИНЖИНИРИНГА ПОЧКИ

В области тканевого инжиниринга применяют принципы биологии и инжи­ниринга для разработки функциональ­ного замещения поврежденной ткани [68]. Десятилетиями исследователи на­пряженно работали для создания техник и методик для разработки биоостова, ис­пользуя натуральные или синтетические биоматериалы [69, 70]. Общее мнение в данной области таково, что для успешно­го применения в тканевом инжиниринге такой остов должен обладать нескольки­ми ключевыми характеристиками с целью поддержания правильного формирования ткани и функции: (а) быть биосовместимым; (б) обладать достаточной механи­ческой силой; (в) быть биоактивным для изменения 3D-клеточного микроокруже­ния и (г) обеспечивать диффузию пита­тельных веществ и очищение от токсич­ных продуктов. В этой области произош­ли значительные достижения, включая успешное создание трансплантатов та­ких тканей, как кожа [71], хрящ [72, 73], кость [74], мочевой пузырь [75], сосуды [76] и трахея [77]. Однако в наше время иссле­дователи стоят лицом к лицу с новой проблемой, относящейся к биоинжинирингу более сложных 3D-органов: легкие, печень, сердце и почки.

Сложные органы требуют интактной сосуди­стой сети, которая далее могла бы быть включена в систему циркуляции после трансплантации ре­ципиенту для обеспечения адекватного питания и кислородной поддержки всему органу. Более того, такие органы обычно обладают высокоорганизо­ванными орган-специфичными многоклеточны­ми структурами, ответственными за выполнение основных функций. Почка представляет собой один из наиболее сложных органов в отношении развития, пространственной организации и кле­точной специализации. Почка человека состо­ит из более чем 30 разных типов клеток и тысяч сложных и функционально разделенных эпители­альных структур, называемых нефронами, кото­рые являются функциональной единицей почки. Каждый нефрон дифференцируется из разных регионов, главным образом из капсулы Боумена, которая окружает клубочек, и почечных каналь­цев, каждый из которых имеет различные анато­мические характеристики и физиологичную роль [16]. Такая сложная органная структура не может быть воспроизведена при использовании тради­ционных методик тканевого инжиниринга остова.

Недавнее получение остова орган-специфичного экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) путем децеллюляризации/рецеллюляризации и возмож­ность точного расположения клеток и материалов путем технологии 3D-биопринтинга представля­ются двумя наиболее обещающими достижения­ми органного биоинжиниринга.

СОЗДАНИЕ ОРГАННЫХ ОСТОВОВ ПУТЕМ ТЕХНОЛОГИИ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ/ РЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ

Децеллюляризация целого органа открывает новые перспективы в тканевом инжиниринге [78]. Несколькоми лабораториями было сообщено о создании почечного остова от грызунов [79-85], свиней [86-88], макак-резус [89] и человеческих почек [5, 90, 91] (табл. 2).

Описано много протоколов децеллюляризации (см. [92-94]), которые обычно включают антеградную перфузию очищающих веществ (детер­гентов), ферментов и других разрушающих клет­ки растворов через сосудистую систему органа для удаления клеточных компонентов, в то же время сохраняя 3D-архитектонику и биохимиче­ский состав нативного ЭЦМ.

После децеллюляризации почечный остов со­храняет гломерулярную и тубулярную архитек­тонику и сосудистую сеть. Интересно, что неко­торые исследования открыли важную роль по­чечного ЭЦМ в управлении поведением клетки. Nakayama и соавт. показали, что чЭСК, подсажен­ные в ЭЦМ децеллюляризованной почки макакрезус, формировали канальцы и экспрессировали ряд специфичных для почки маркеров, но эти со­бытия не происходили, когда использовали ЭЦМ легкого, показывая определенную специфичность функций почечного ЭЦМ [95]. Действительно, в недавней публикации O’Neill и соавт. [96] было описано, что полученные из сосочка почечные стволовые клетки регулируются по-разному при культивировании в контакте с разными регионами ЭЦМ почки, предполагая регион-специфичный эффект ЭЦМ почки на поведение стволовых кле­ток. Более того, в недавнем исследовании Yu и соавт. [97] бесклеточный ЭЦМ почечного остова крысы был пересажен в частично нефрэктомированные почки крысы и показал некоторое возоб­новление роста удаленной области спустя 4 нед после трансплантации. Интересно, что микро­скопический анализ показал миграцию нестинпозитивных клеток из поврежденной почки в трансплантированный бесклеточный остов, де­монстрируя, что интактный бесклеточный почеч­ный остов сохраняет биоактивные сигналы. Одна­ко ни одного значимого восстановления почечной функции показано не было. В общем, эти работы поддерживают идею, что бесклеточный почечный ЭЦМ сохраняет ренальные специфичные биохи­мические и биофизические сигналы, которые спо­собны регулировать клеточную пролиферацию и дифференцировку. Хотя лежащие в основе ме­ханизмы еще должны быть изучены, эти данные предполагают, что ЭЦМ остова органа, получен­ный путем децеллюляризации, мог бы быть иде­альной системой для обеспечения клеткам необ­ходимого орган-специфичного микроокружения для создания функционирующих почек.

Несмотря на эти впечатляющие данные, ко­личество исследований, продемонстрировавших успешную трансплантацию целиком рецеллю- ляризированных почек, ограничено [80, 83-85, 87]. Одно из главных препятствий до настояще­го времени - это необходимость эффективно реэндотелизировать сосудистую сеть созданной почки перед имплантацией для того, чтобы избе­жать массивных тромбозов при соединении с со­судистой системой реципиента. Orlando и соавт. [87] имплантировали децеллюляризированный почечный остов свиньи в животное-реципиента, поддерживая достаточное кровяное давление в течение операции; однако в отсроченном периоде, составившем 2 нед, авторы доложили о массив­ных тромбозах, подчеркнув факт того, что эндоте- лизация сосудистой системы остова является ре­шающим требованием для проведения успешной пересадки и длительной жизни трансплантата. Peloso и соавт. [84] также наблюдали ту же пробле­му формирования тромбов при имплантации децеллюляризированного почечного остова крысам. Примечательно, что в исследовании, проведенном Ott [80], целиком бесклеточные почки крыс были рецеллюляризированы почечными клетками но­ворожденной крысы и клетками эндотелия пу­почной вены человека и далее имплантированы ортотопически, что привело к некоторому восста­новлению почечной фильтрации и реабсорбции. В этой важной концептуальной работе не было выявлено признаков кровотечения или образова­ния тромба в течение процесса имплантации, до­казывая важность реэндотелизации сосудистой сети бесклеточного остова. Все эти работы под­тверждают, что ортотопическая трансплантация почечного остова в наши дни технически возмож­на, и что надлежащая рецеллюляризация таких остовов необходима для последующего достиже­ния эффективной трансплантации и функциони­рования органа.

Оптимальный источник клеток для внедрения в бесклеточный почечный остов - это другой не­решенный вопрос. В настоящее время исследова­тели стараются рецеллюляризировать почечный остов с помощью различных клеточных источ­ников, включая почечные клетки новорожденных [80], эндотелиальные клетки пупочной вены чело­века [80], мышиные ЭСК [82, 85], эндотелиальные клетки из чиПСК [83], иммортализованные клетки почечного кортикального эпителия человека [83], линию клеток карциномы поджелудочной желе­зы человека [84] и первичные почечные клетки свиньи [98]. Учитывая последние достижения в технологиях иПСК и генного редактирования, а также самый последний прогресс в разработке протоколов для ренальной дифференцировки ПСК в надлежащие типы почечных клеток, представ­ляется, что ПСК-почечные клетки будут идеаль­ным источником для создания целого органа (что обсуждается выше в разделе терапия стволовы­ми клетками для регенерации почки). Считается, что предшественники почечных клеток из ПСК- клеток будут подходить для биоинжиниринга почки в большей степени, чем зрелые фенотипы почечных. Тем не менее, большой объем работы еще предстоит выполнить, чтобы точно охаракте­ризовать и признать пригодными популяции кле­ток из ПСК в отношении клеточной идентичности, дифференцировки и финального созревания для обеспечения надлежащей репопуляции различных почечных отделов, а также выполнения необходи­мых физиологических функции почки.

В текущих работах обычно используют почеч­ную артерию [79-82, 99] или мочеточник [79, 80] в качестве пути доставки клеток в почечный остов. Однако выбор пути для клеточного осеменения должен быть изучен в большей степени, учитывая, что различные биохимические и биофизические сигналы от различных отделов ЭЦМ могут влиять на клеточную пролиферацию, дифференцировку и дальнейшее созревание, как предполагается не­которыми исследованиями [95, 96]. В настоящий момент для доставки клеток в почечный остов и обеспечения стандартной доставки питательных веществ и кислорода в рецеллюляризированный почечный остов используют самодельные биоре­акторы. Song и соавт. [80] разработали биореак­тор, который позволяет осуществлять перфузию как через почечную артерию, так и мочеточник, включая порт для забора воздуха для генерирова­ния среды отрицательного давления и создания трансренального градиента давления, который улучшает прохождение клеток через мочеточник. Однако, до сих пор главной проблемой остается неравномерное распределение клеток, обычно на­блюдаемое после осеменения, с неспособностью клеток в ряде случаев достичь клубочка и, как правило, неэффективность формирования клеточ­ной плотности, сравнимой с нативным органом. Поэтому дальнейшая оптимизация систем биоре­актора будет необходима для достижения полной рецеллюляризации и созревания органа перед им­плантацией [100].

В целом возможность совмещения бесклеточного почечного ЭЦМ остова с почечными клетками из чиПСК является уникальной технологической платформой для инжиниринга почки [101]. В не­скольких статьях уже показана возможность при­менения технологии децеллюляризации к почкам человека [5, 90, 91], хотя ни в одном из этих иссле­дований не изучали рецеллюляризацию. Будущие направления потребуют определения оптимальных условий рецеллюляризации (клеточная плотность, путь доставки клеток и методика осеменения) с це­лью улучшения клеточной плотности, распределе­ния и задержки в различных областях бесклеточного почечного остова. Более того, расширение технологии рецеллюляризирования почечного остова человека потребует улучшения протоколов по кле­точной дифференцировке, стратегий эффективной доставки клеток и инновационных систем биоре­акторов с физиологически необходимыми условия­ми клеточных культур (объем, давление, скорость потока и механические стимулы) с целью создания функционирующей человеческой почки [100, 102].

 

Таблица 2

Последние литературные данные по стратегиям децеллюляризации/рецеллюляризации почки

Рецеллюляризация

Автор и год

Вид

Децеллюляризация

Засеянные клетки

Метод засеивания

Метод культивирования остова

Имплантация

Основные исходы

Ross et al. (2009) [79], (2012) [99]

Крыса линии

Спрег-Доули

Гравитационная перфузия (при 100 мм рт. ст.) через почечную артерию и моче­точник с (а) 3% Тритоном X-100, (б) деоксирибону- клеазой, (в) 3% Тритоном X-100, (г) 4% додецилсуль- фатом натрия (ДСН)

Мышиные ЭСК

Инъекция через артерию и мо­четочник вручную

Автоматизированная перфузионная система, разработанная для под­держания давления на уровне 120/80 мм рт. ст.

Нет

Клетки, введенные в артерию, сна­чала попали в клубочки, но потом мигрировали в сосудистую сеть в процессе культивирования. Клетки, введенные в мочеточник, распреде­лились неравномерно

Song et al. (2013) [80]

Крыса линии

Спрег-Доули

Перфузия почечной арте­рии при постоянном дав­лении 40 мм рт. ст. 1 % ДСН 12 ч, 1% Тритоном X-100 30 мин

Клетки почки ново­рожденной крысы и эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs)

Засеивание HUVECs при арте­риальном кровотоке 1 мл/мин 1 с последующей статической ин­кубацией в течение ночи. Клетки почки новорожденной крысы засеивались через мочеточник при отрицательном градиенте давления, достигнутом в камере биореактора

Культура, перфузируемая артериально со скоро­стью 1,5 мл/мин 1 в био­реакторе

Ортотопи- ческая им­плантация крысе

Частичное восстановление по­чечной фильтрации и реабсорбции электролитов. Рецеллюляризация 70% клубочков. Тромбообразования или кровотечения во время имплан­тации не было

Bonandrini et al. (2014) [82]

Крыса линии

Спрег-Доули

Перфузия почечной арте­рии со скоростью 0,4 мл/ мин 1 при давлении 62-107 мм рт. ст. с 1 % ДСН 17 ч

R1мышиные ЭСК

Динамическое засеивание че­рез почечную артерию 0,2 мл/ мин 1

Культура, перфузируемая в биореакторе

Нет

Снижение экспрессии ОСТ4 и уве­личение NCAM, Tie-2 и CD31

Sullivan et al. (2012) [86]

Йорк­ширская свинья

Перфузия почечной арте­рии с 0,5% ДСН и деоксири- бонуклеазой в течение ночи

Первичные корти­кальные почечные клетки человека

5 X 7 мм биопсии коры были за­сеяны статически

Статическое культивиро­вание 3-4 дня

Нет

Клеточная пролиферация. Лучшее действие ДСН при сравнении с Тритоном X-100

Nakayama et al. (2010) [89], (2013) [95]

Макакрезус

Срезы почки: 1% ДСН 7-10 дней

WA09 человеческие ЭСК

Срезы почки 8 мм в диаметре были статически засеяны клет­ками

Статическое культивиро­вание в течение 8 дней

Нет

Увеличение экспрессии генных маркеров почечных канальцев

O’Neill et al. (2013) [96]

Йоркширская свинья

0,02% трипсин 2 ч, 3%Твин (Tween) 2 ч, 4% деоксихолат натрия 2 ч

Мышиные почечные стволовые клетки и мышиные мезенхимальные стволовые клетки

Клетки помещались на сре­зы децеллюляризированного остова, ЭСК-гидрогель и рас­творимый ЭЦМ

Статическое культивиро­вание до 7 дней

Нет

Сосочковый ЭЦМ ингибировал пролиферацию и увеличивал метаболическую активность почечных стволовых клеток

Caralt et al. (2014) [83]

Крыса линии

Спрег-Доули

Три метода: (а) 1% Тритон X-100; (б) 1 % Тритон X-100 и 0,1 % ДС H; (в) 0,05% EDTA с 0,02% трипсином и 1% Тритоном X-100

Человече­ские иПСК- эндотелиальные клетки и оживлен­ные эпители­альные клетки кортикальных по­чечных канальцев человека (RCTEs)

Вручную инъецированы или инфузированы через антеградную перфузию биореактора в почечную артерию со скоростью 25 мл/мин 1 на 15 мин

Статическое культиви­рование в течение 36 ч и культивирование при перфузии в биореакторе при скорости 4 мл/мин 1 до I дней

Нет

Эндотелиальные клетки обнару­жены в сосудистом русле, a RCTEs образовали структуры канальцев. Доступ кислорода был ограничен в некоторых участках

 

Продолжение табл. 2

Peloso et al. (2015) [84]

Крыса линии

Льюис

Аортальная антеградная пульсовая перфузия с Три­тоном X-100 I % при скоро- сти70мл/мин 1 (1 ч 25мин), затем PBS со скоростью 50 мл/мин 1 (1 ч), после ДСН 1% при скорости 70 мл/ мин 1 (1 ч 25 мин)

Клетки карциномы поджелудочной железы человека (MIA РаСа-2)

Инъецирование вручную через сосудистое русло почечной артерии

Орган перфузировался в биореакторе со спец­ифичным способом 24 ч со скоростью потока 1 мл/мин 1

Ортотопи- ческая имплантация крысе

Гомогенное распределение клеток в почечном матриксе и отсутствие токсичности остова. Отсутствие эндотелия сосудистой сети по­сле трансплантации обеспечивает прямой контакт между кровью и ЭЦМ, что приводит к интенсивной активации каскада коагуляции и формированию сгустков

Guan et al. (2015) [85]

Крыса линии

Вистар

Перфузия почечной ар­терии 2 мл/мин 1 с 0,01 м PBS 15 мин, 0,5% ДСН 4 ч и затем PBS 24 ч для уда­ления ДСН

Мышиные ЭСК

Засеяны вручную через почеч­ную артерию и мочеточник

Клетки могли прижив­ляться в течение ночи, после чего перфузия возобновлялась при скоро­сти 1 мл/мин 1

Ортотопическая имплантация крысе

Увеличение репопуляции клеток целого почечного остова при контролируемых условиях перфузии. ЭСК прикрепились к ЭЦМ и про­лиферировали. Сосудистое дерево полностью было окклюзировано тромбами

Guan et al. (2015) [88]

Обычная свинья

Перфузия почечной арте­рии: дистиллированная вода 10 мл/мин 1 2 ч, 1% ДСН 10 мл/мин 1 28 ч и 1 % Тритон X-100 2 ч, финаль­ная отмывка PBS 10 мл/ мин1 4 дня

Мышиные ЭСК

Множественное пункционное засеивание инжектором 28G

Клетки могли прижив­ляться в течение 4 ч, затем почечный остов соединяли с системой биореактора и перфу- зировали при скорости 2 мл/мин 17 дней

Нет

Примененный протокол децеллюляризации значительно снижал содержание ДНК, поддерживая при этом основные структурные осо­бенности и задерживая цитокины

Orlando et al.

(2013) [90]

Удаленные человеческие почки

Дистиллированная вода 12 мл/мин1 12 ч, 0,5% ДСН 12 мл/мин 148 ч как в почечной артерии, таки в мочеточни­ке, финальная отмывка PBS 6 мл/мин1 5 дней

 

 

 

Нет

Оптимизирование децелл поляриза­ции путем перфузии через артерию и также мочеточник ретроградно в собирательную систему. Про­демонстрирована способность к ангиогенезу ЭЦМ остова.

Peloso et al. (2015) [91]

Уда­ленные челове­ческие почки

PBS при скорости 12 мл/ мин1 12ч, 0,5%ДСН 12мл/ мин 1 48 ч как в почечной артерии, так и в мочеточ­нике, финальная отмывка деоксирибонуклеазой 6 ч при скорости 6 мл/мин 1 и затем PBS 6 мл/мин 1 5 дня

 

 

 

Нет

Морфология и пространственность бесклеточного клубочка и его со­судистая сеть были относительно хорошо сохранены после децеллюляризации и сравнимы с клеточным двойником. Сосудистая сеть со­хранила свою нативную эластич­ность. Цитокины остались внутри матрикса после децеллюляризации в значительной концентрации

Abolbashari et al. (2016) [98]

Йорк­ширская свинья

Перфузия почечной арте­рии 0,5% ДСН 36 ч и деоксирибонуклеазой в течение ночи

Первичные почеч­ные клетки свиньи

Множественные клеточные инъ­екции в кортикальный регион почечного остова. Оптимизиро­ванный метод инъекции клеток, способный восстановить популяцию 50% верхнего полюса почки

Перфузия в биореакторе при скорости 10 мл/мин1 напрямую в почку через почечную артерию

Нет

Клеточная организация в надлежа­щую структуру почечных канальцев без вовлечения в засеивание со­судистой сети. Уровень активности гидролаз был сравним с нормаль­ной почкой. Продукцияэритропоэтина восстановленными почечными клетками все время увеличивалась при культивировании в биореакто­ре, показывая на клинически важ­ную функциональную продукцию

Эта таблица представляет обзор нескольких недавних публикаций, в которых описаны децеллюляризация и рецеллюляризация целой почки in vitro при использовании различных типов клеток. Также подробно описаны видовая принадлежность децеллюляризированной почки, главные условия децеллюляризации, засеянные типы клеток, метод засеивания, методика культивирования почечного остова и основные результаты.

3D-БИОПРИНТИНГ

SD-биопринтинг использует последние раз­работки в прикладных производственных техно­логиях (также известный как SD-принтинг) по тщательному депонированию живых клеток или клеточных масс вместе с поддерживающим био­материалом на основе гидрогеля (вместе называе­мыми биочернилами) для точной геометрии при построении орган-подобных или тканевых струк­тур в трех измерениях [103, 104]. В последние годы были сделаны новые достижения в разработ­ке различных техник биопринтинга для создания 3D-тканеподобной живой структуры (см. в [6]), включая базирующиеся на инжекторном клеточ­ном принтинге, экструзии, мягкой литографии и лазер-индуцированном переносе. Все они содер­жат компьютерное устройство, которое транс­лирует в трех измерениях сложную геометрию с целью повторения специфических биологических признаков ткани или даже целого органа.

Несмотря на огромный потенциал этой техно­логии в области тканевого инжиниринга, одним из главных препятствий, требующих решения в первую очередь, остается недостаток адекватного биоматериала для успешного биопринтинга жи­вых структур.

Много исследований проводятся в этой об­ласти для разработки новых классов биочернил, что полноценно освещено в других источниках [105-107]. Интересно, что в недавней работе Pati и соавт. [108] были изготовлены биочернила из децеллюляризированных жировой, хрящевой и сердечной тканей и использованы для принтинга нагруженных клетками конструкции с регули­руемой пористостью. Авторы продемонстриро­вали возможность создания тканевых аналогов in vitro как с адипогенным, так и хондрогенным потенциалом, показав стволовые клетки из че­ловеческой жировой ткани и мезенхимальные стволовые клетки из ткани нижней носовой рако­вины человека, напечатанные при использовании ЭЦМ-биочернил, полученных из жировой ткани и хрящевой ткани соответственно. В контексте регенерации почки успешное создание функцио­нального почечного остова путем биопринтинга будет ограничено возможностью повторения ренального ЭЦМ в отношении композиции и про­странственной организации, как и депонирования различных популяций почечных клеток органи­зованным образом. В связи с этим биочернила, полученные из бесклеточного почечного ЭЦМ, станут привлекательным материалов, так как это может обеспечить реноспецифичные внутриструктурные сигналы для напечатанных клеток.

Хотя технология 3D-биопринтинга пока толь­ко в самом раннем периоде развития, уже показан ее потенциал в создании органов. Группа Atala смогла смоделировать напечатанный мочевой пу­зырь, используя модифицированную технологию инжекторного биопринтинга [109], показав, что возможно печатать различные типы клеток в орга­низованной 3D-структуре. Эта оригинальная ра­бота открыла новые перспективы в 3D-принтинге органа в целом. Такие достижения, как использо­вание тканевых сфероидов в качестве строитель­ных блоков, продемонстрировали большой успех в создании микротканей, например, сосудистой сети [110, 111], которые в дальнейшем могут быть объединены в организованную макроткань.

Хотя большой объем работы еще должен быть проделан перед тем как полностью функциони­рующая почка сможет быть напечатана, предва­рительным шагом будет создание мелких орга­ноидов или функциональных единиц, таких как нефрон, которые будут полезны для применения при лекарственном скрининге и моделировании заболеваний. Уже некоторые работы исследуют применение чПСК в биопринтинге [112, 113] для изучения возможных эффектов параметров про­цесса биопринтинга на жизнеспособность клетки и потенциал дифференцировки.

В отношении инжиниринга целого органа не­сколько проблем должны быть приняты во вни­мание для реализации этой техники [103, 104]: а) разработка новых биочернил (т.е. ткань спец­ифичных биочернил); б) улучшение устройств биопринтинга с достаточным пространствен­ным разрешением для копирования иерархичной структуры сложного органа и сложности клеток органа; с) необходимость васкуляризации; д) раз­работка адаптированной перфузии биореакторов, подходящих для биопринтинга и дальнейшего со­зревания органа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Последние три года оказались впечатляющими в области инжиниринга почечной ткани.

Недавние работы демонстрируют осуществи­мость не только создания почечных клеток из пациент-специфичных иПСК, но и понимание сигналов, управляющих их образованием in vitro. Обнаруженные различия в данных указывают, что образованные почечные SD-структуры при ком­бинации почечных дифференцированных клеток из чПСК имеют различную степень функциональ­ного потенциала. Таким образом, предполагается, что необходимо развивать в дальнейшем мето­дики in vivo, доказывающие функциональность созданных из иПСК пациента почечных клеток, например, их трансплантация в нефрэктомически поврежденную почку на мышиных моделях. Кро­ме того, необходимо понимать, какие молекуляр­ные компоненты определяют почечную идентич­ность в ходе развития у человека, а создание ре­портерных ПСК для почечных маркеров являются необходимыми для всестороннего анализа разви­тия почки, приводя к разработке новых протоко­лов для формирования зрелых и функциональных почечных клеток.

Другая проблема, относящаяся к инжинирингу почки, касается разработки инновационных мето­дов, позволяющих имитировать такую сложную структуру органа. Недавно две разные стратегии привлекли внимание ученых - инжиниринг цело­го органа путем децеллюляризации/рецеллюляризации и биопринтинг живых орган-подобных структур, что могло бы стать новым источником органного обеспечения.

В заключение, продолжающиеся исследова­ния в области регенеративной медицины будут напрямую способствовать созданию новых стра­тегий биоинжиниринга почки: от производства биоостова и SD-живых структур до продукции по­чечных клеток из иПСК пациента в клинической практике.

Список литературы

1. https://www.kidney.org/news/newsroom/factsheets/Organ-Donation-and-Transplantation-Stats.

2. http://optn.transplant.hrsa.gov/3. Song B, Smink AM, Jones CV, et al. The directed differentiation of human iPS cell into kidney podocytes. PLoS One 2012; 7, e46453

3. Narayanan K, Schumacher KM, Tasnim F et al. Human embryonic stem cells differentiate into functional renal proximal tubular-like cells. Kidney 2013; Int 83, 593–603

4. Кatari R, Peloso A, Zambon JP et al. Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys. Nephron 2014; Exp Nephrol 126, 119–124

5. Mandrycky C, Wang Z, Kim K & Kim DH. 3D bioprinting for engineering complex tissues. Biotechnol 2015; Adv doi: 10.1016/j. biotechadv.2015.12.011

6. Montserrat N, Ramırez-Bajo MJ, Xia Y et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human renal proximal tubular cells with only two transcription factors, OCT4 and SOX2. J Biol Chem 2012; 287, 24131–24138

7. Baer PC, Geiger H. Human renal cells from the thick ascending limb and early distal tubule: characterization of primary isolated and cultured cells by reverse transcription polymerase chain reaction. Nephrology 2008; 13, 316–321

8. Baer PC, Nockher WA, Haase W, Scherberich JE. Isolation of proximal and distal tubule cells from human kidney by immunomagnetic separation. Technical note. Kidney 1997; Int 52, 1321–1331

9. Humphreys BD, Czerniak S, DiRocco DP, et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108, 9226-9231

10. Song J, Czerniak S, Wang T et al. Characterization and fate of telomerase-expressing epithelia during kidney repair. J Am Soc Nephrol 2011; 22, 2256–2265

11. Humphreys BD, Valerius MT, Kobayashi A et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell 2008; 2, 284–291

12. Romagnani P, Lasagni L, Remuzzi G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat Rev Nephrol 2013; 9, 137–146

13. Romagnani P, Anders H-J. What can tubular progenitor cultures teach us about kidney regeneration? Kidney 2013; Int 83, 351–353

14. Osafune K, Takasato M, Kispert A, Asashima MNR. Identification of multipotent progenitors in the embryonic mouse kidney by a novel colonyforming assay. Development 2006; 133, 151–161

15. Little MH, McMahon AP. Mammalian kidney development: principles, progress, and projections.Cold Spring Harb Perspect Biol 2012; 4, 3

16. Thomson JA. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282, 1145–1147

17. Wakayama T, Tabar V, Rodriguez I et al. Differentiation of embryonic stem cell lines generated from adult somatic cells by nuclear transfer. Science 2001; 292, 740–743

18. Tada M, Takahama Y, Abe K et al. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Curr Biol 2001; 11, 1553–1558

19. Hou P, Li Y, Zhang X et al. Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by smallmolecule compounds. Science 2013; 341, 651–654

20. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007; 131, 861–872

21. Kazutoshi Takahashi SY. A developmental framework for induced pluripotency. Development 2015; 142,3274–3285

22. .Zhu S, Li W, Zhou H, Wei et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell 2010; 7, 651–655

23. Aasen T, Raya A, Barrero MJ et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol 2008; 26, 1276–1284

24. Giorgetti A, Montserrat N, Aasen T et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell 2009; 5, 353–357

25. Kim JB, Greber B, Ara et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature 2009; 461, 649–643

26. Gonzalez F, Boue S, Belmonte JCI. Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte. Nat Rev Genet 2011; 12, 231–242

27. Zhou H, Wu S, Joo JY et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell 2009; 4, 381–384

28. Kim D, Kim C-H, Moon J-I et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell 2009; 4, 472–476

29. Okita K, Matsumura Y, Sato Y et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods 2011; 8, 409–412

30. Warren L, Manos PD, Ahfeldt T et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell 2010; 7, 618–630

31. Anokye-Danso F, Trivedi CM, Juhr D et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell 2011; 8, 376–388

32. Meng G, Liu S, Rancourt DE. Synergistic effect of medium, matrix, and exogenous factors on the adhesion and growth of human pluripotent stem cells under defined, xeno-free conditions. Stem Cells Dev 2012; 21, 2036–2048

33. Sugii S, Kida Y, Kawamura T et al. Human and mouse adiposederived cells support feeder-independent induction of pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107, 3558–3563.

34. Nakagawa M, Taniguchi Y, Senda S et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep 2014; 4, 3594

35. Raya A, Rodrıguez-Piza I, Guenechea G et al. Diseasecorrected haematopoietic progenitors from Fanconi anaemia induced pluripotent stem cells. Nature 2009; 460, 53–59

36. Ebert AD, Yu J, Rose FF et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature 2009; 457, 277–280

37. Ye L, Chang JC, Lin C et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106, 9826–9830

38. Liu G-H, Barkho BZ, Ruiz S et al. Recapitulation of premature aging with iPSCs from Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Nature 2009; 472, 221–225

39. Itzhaki I, Maizels L, Huber I et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature 2011; 471, 225–229

40. Nguyen HN, Byers B, Cord B et al. LRRK2 mutant iPSCderived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell 2011; 8, 267–280

41. Lee G, Papapetrou EP, Kim H et al. Modeling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient specific iPSCs. Nature 2011; 461, 402–406

42. Moretti A, Bellin M, Welling A et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med 2010; 363, 1397–1409

43. Li M, Suzuki K, Kim NY et al. A cut above the rest: targeted genome editing technologies in human pluripotent stem cells. J Biol Chem 2014; 289, 4594–4599

44. Liu G-H, Suzuki K, Qu J et al. Targeted gene correction of laminopathyassociated LMNA mutations in patient-specific iPSCs. Cell Stem Cell 2011; 8, 688–694

45. Howden SE, Gore A, Li Z et al. Genetic correction and analysis of induced pluripotent stem cells from a patient with gyrate atrophy. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108, 6537–6542

46. Papapetrou EP, Lee G, Malani N et al. Genomic safe harbors permit high b-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol 2011; 29,73–78

47. Li M, Suzuki K, Qu J et al. Efficient correction of hemoglobinopathycausing mutations by homologous recombination in integration-free patient iPSCs. Cell Res 2011; 21, 1740–1744

48. Liu G-H, Qu J, Suzuki K et al. Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2. Nature 2012; 491, 603–607

49. Fattahi F, Steinbeck JA, Kriks S et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature 2016; 531, 105–109

50. Tiscornia G, Vivas EL, Izpisua Belmonte JC. Diseases in a dish: modeling human genetic disorders using induced pluripotent cells. Nat Med 2011; 17, 1570–1576

51. Shankland SJ, Pippin JW, Reiser J, Mundel P. Podocytes in culture: past, present, and future. Kidney Int 2007; 72, 26–36

52. Mae S-I, Shono A, Shiota F et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun 2013; 4, 1367

53. Araoka T, Mae S, Kurose Y et al. Efficient and rapid induction of human iPSCs/ESCs into nephrogenic intermediate mesoderm using small molecule-based differentiation methods. PLoS One 2014; 9, e84881

54. Xia Y, Nivet E, Sancho-Martinez I et al. Directed differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud kidney progenitorlike cells. Nat Cell Biol 2013; 15, 1507–1515

55. Takasato M, Er PX, Becroft M et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol 2014; 16, 118–126

56. Lam AQ, Freedman BS, Morizane R et al. Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers. J Am Soc Nephrol 2013; 25, 1211–1225

57. Taguchi A, Kaku Y, Ohmori T et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 2014; 14, 53–67

58. Imberti B, Tomasoni S, Ciampi O et al. Renal progenitors derived from human iPSCs engraft and restore function in a mouse model of acute kidney injury. Sci Rep 2015; 5, 8826

59. Morizane R, Lam AQ, Freedman BS et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nat Biotechnol 2015; 33, 1193–1200

60. Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nat Commun 2015; 6, 8715

61. Takasato M, Er PX, Chiu HS et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature 2015; 526, 564–568

62. Xiao-Jie L, Hui-Ying X, Zun-Ping K et al. CRISPR-Cas9: a new and promising player in gene therapy. J Med Genet 2015; 52, 289–296

63. Hu J, Lei Y, Wong W-K, Liu S et al. Direct activation of human and mouse Oct4 genes using engineered TALE and Cas9 transcription factors. Nucleic Acids Res 2014; 42, 4375–4390

64. Elliott DA, Braam SR, Koutsis K et al. NKX2-5eGFP/w hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods 2011; 8, 1037–1040

65. Den Hartogh SC, Schreurs C, Monshouwer-Kloots JJ et al. Dual reporter MESP1 mCherry/w -NKX2-5 eGFP/w hESCs enable studying early human cardiac differentiation. Stem Cells 2015; 33, 56–67

66. Krentz NA, Nian CLF. TALEN/CRISPRmediated eGFP knock-in add-on at the OCT4 locus does not impact differentiation of human embryonic stem cells towards endoderm. PLoS One 2014; 9, e114275

67. Langer R, Vacanti JP. Tissue engineering. Science 1993; 260, 920–926 69. Kim TG, Shin H, Lim DW. Biomimetic scaffolds for tissue engineering. Adv Funct Mater 2012; 22, 2446–2468

68. Mallick KK, Cox SC. Biomaterial scaffolds for tissue engineering. Front Biosci 2013; 5, 341–360

69. Kamel RA, Ong JF, Eriksson E et al. Tissue engineering of skin. J Am Coll Surg 2013; 217: 533–555

70. Sittinger M, Bujia J, Minuth WW et al. Engineering of cartilage tissue using bioresorbable polymer carriers in perfusion culture. Biomaterials 1994; 15, 451–456

71. Liao J, Guo X, Grande-Allen KJ et al. Bioactive polymer/ extracellular matrix scaffolds fabricated with a flow perfusion bioreactor for cartilage tissue engineering. Biomaterials 2010; 31, 8911–8920

72. Amini AR, Laurencin CT, Nukavarapu SP. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Crit Rev Biomed Eng 2012; 40, 363–408

73. Atala A. Tissue engineering of human bladder. Br Med Bull 2011; 97, 81–104

74. Koike N, Fukumura D, Gralla O et al. Tissue engineering: creation of longlasting blood vessels. Nature 2004; 428, 138–139

75. Kojima K, Vacanti CA.Tissue engineering in the trachea. Anat Rec 2014; 297, 44–50

76. Tapias LF, Ott HC. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant 2014; 19, 145–152

77. Ross EA, Williams MJ, Hamazaki T et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol 2014; 20, 2338–2347

78. Song JJ, Guyette JP, Gilpin SE et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med 2013; 19, 646–651

79. Burgkart R, Tron A, Prodinger P et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods 2014; 20, 553–561

80. Bonandrini B, Figliuzzi M, Papadimou E et al. Recellularization of wellpreserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A 2014; 20, 1486–1498

81. Caralt M, Uzarski JS, Iacob S et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. Am J Transplant 2014; 15, 64–75

82. Peloso A, Ferrario J, Maiga B et al. Creation and implantation of acellular rat renal ECM-based scaffolds. Organogenesis 2015; 1, 58–74

83. Guan Y, Liu S, Sun C et al. The effective bioengineering method of implantation decellularized renal extracellular matrix scaffolds. Oncotarget 2015; 6, 36126–36138

84. Sullivan DC, Mirmalek-Sani SH, Deegan DB et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials 2012; 33, 7756–7764

85. Orlando G, Farney AC, Iskandar SS et al. Production and implantation of renal extracellular matrix scaffolds from porcine kidneys as a platform for renal bioengineering investigations. Ann Surg 2012; 256, 363–370

86. Guan Y, Liu S, Liu Y et al. Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2015; 56, 451–456

87. Nakayama KH, Batchelder CA, Lee CI, Tarantal AF. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng Part A 2010; 16, 2207–2216

88. Orlando G, Booth C, Wang Z et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials 2013; 34, 5915–5925

89. Peloso A, Petrosyan A, Da Sacco S et al. Renal extracellular matrix scaffolds from discarded kidneys maintain glomerular morphometry and vascular resilience and retains critical growth factors. Transplantation 2015; 99, 1807–1816

90. Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials 2012; 32, 3233–3243

91. He M, Callanan A. Comparison of methods for whole-organ decellularization in tissue engineering of bioartificial organs. Tissue Eng Part B Rev 2013; 19, 194–208

92. Keane TJ, Swinehart I, Badylak SF. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in-vivo relevance. Methods 2015; 84, 25–34

93. Nakayama KH, Lee CCI, Batchelder CA, Tarantal AF. Tissue specificity of decellularized rhesus monkey kidney and lung scaffolds. PLoS One 2013; 8, e64134

94. O’Neill JD, Freytes DO, Anandappa AJ et al. The regulation of growth and metabolism of kidney stem cells with regional specificity using extracellular matrix derived from kidney. Biomaterials 2013; 34, 9830–9841

95. Yu YL, Shao YK, Ding YQ et al. Decellularized kidney scaffold-mediated renal regeneration. Biomaterials 2014; 35, 6822–6828

96. Abolbashari M, Agcaoili SM, Lee MK et al. Repopulation of porcine kidney scaffold using porcine primary renal cells. Acta Biomater 2016; 29, 52–61

97. Ross EA, Abrahamson DR, St. John P et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis 2012; 8, 49–55

98. Bijonowski BM, Miller WM, Wertheim JA. Bioreactor design for perfusion-based, highly vascularized organ regeneration. Curr Opin Chem Eng 2013; 2, 32–40

99. Pollock CA. Toward a bioartificial kidney: will embryonic stem cells be the answer? Kidney 2013; Int 83, 543–545

100. Badylak SF, Taylor D, Uygun K. Wholeorgan tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng 2011; 13, 27–53

101. Murphy SV, Atala A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotechnol 2014; 32, 773–785

102. Groll J, Boland T, Blunk T et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication 2016; 8, 013001

103. Skardal A, Atala A. Biomaterials for integration with 3-D bioprinting. Ann Biomed Eng 2015; 43, 730–746

104. Chung JHY, Naficy S, Yue Z et al. Bio-ink properties and printability for extrusion printing living cells. Biomater Sci 2013; 1, 763

105. Ferris CJ, Gilmore KJ, Beirne S et al. Bio-ink for ondemand printing of living cells. Biomater Sci 2013; 1, 224

106. Pati F, Jang J, Ha D-H, et al. Printing threedimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nat Commun 2014; 5, 3935

107. Fullhase C, Soler R, Atala A et al. A novel hybrid printing system for the generation of organized bladder tissue. J Urol 2009; 181, 282–283

108. Williams SK, Touroo JS, Church KH, Hoying JB. Encapsulation of adipose stromal vascular fraction cells in alginate hydrogel spheroids using a direct-write three-dimensional printing system. Biores Open Access 2013; 2, 448–454

109. Mironov V, Visconti RP, Kasyanov V et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials 2009; 30, 2164–2174

110. Faulkner-Jones A, Greenhough S, King JA et al. Development of a valve-based cell printer for the formation of human embryonic stem cell spheroid aggregates. Biofabrication 2013; 5, 015013

111. Faulkner-Jones A, Fyfe C, Cornelissen DJ, Gardner et al. Bioprinting of human pluripotent stem cells and their directed differentiation into hepatocyte-like cells for the generation of minilivers in 3D. Biofabrication 2015; 7, 044102


Об авторах

Н. Монтсеррат
Институт Биоинжиниринга Каталонии (IBEC); Сетевой биомедицинский исследовательский центр биоинжиниринга, биоматериалов и наномедицины (CIBER-BBN)
Испания
Программы по плюрипотентным стволовым клеткам и активации эндогенной ткани для регенерации органов (PR Lab)


Е. Гаррета
Институт Биоинжиниринга Каталонии (IBEC);
Испания
Программы по плюрипотентным стволовым клеткам и активации эндогенной ткани для регенерации органов (PR Lab)


Х.К.И. Бельмонте
Институт биологических исследований Солка
Соединённые Штаты Америки
Лаборатория экспрессии гена


Для цитирования:


Монтсеррат Н., Гаррета Е., Бельмонте Х. РЕГЕНЕРАТИВНЫЕ СТРАТЕГИИ РЕКОНСТРУИРОВАНИЯ ПОЧКИ. Нефрология. 2016;20(6):10-25.

For citation:


Montserrat N., Garreta E., Belmonte J. REGENERATIVE STRATEGIES FOR KIDNEY ENGINEERING. Nephrology (Saint-Petersburg). 2016;20(6):10-25. (In Russ.)

Просмотров: 185


ISSN 1561-6274 (Print)
ISSN 2541-9439 (Online)