РЕГЕНЕРАТИВНЫЕ СТРАТЕГИИ РЕКОНСТРУИРОВАНИЯ ПОЧКИ

ВВЕДЕНИЕ

Болезни почек представляют собой одну из основных проблем здравоохранения в современ­ном обществе. Хроническая болезнь почек (ХБП) является ведущей причиной смертности и заболе­ваемости в западных странах, где её распростра­ненность составляет до 11% взрослого населения. ХБП может прогрессировать до неизлечимой стадии терминальной почечной недостаточно­сти (ТПН), требующей проведения диализа или трансплантации почки, что предпочтительно. К слову, затраты только на диализ составляют около 2% от национальных бюджетов здравоохранения, и в течение нескольких лет этот параметр удвоит­ся. Если эта тенденция продолжится, националь­ные правительства будут вынуждены тратить от 3 до 5% своего годового бюджета здравоохранения на заместительную почечную терапию, без учета огромной стоимости дополнительных медицин­ских расходов.

В настоящее время в США 122 403 человека ожидают жизнесохраняющую органную транс­плантацию, из которых 101 189 ожидают транс­плантацию почки [1, 2]. Среднее время ожидания первого почечного трансплантата составляет 3,6 года и может варьировать в зависимости от раз­личных параметров, таких как коморбидность, совместимость и доступность органа [2]. Заслу­живает внимания то, что в 2014 году в США было выполнено 17 105 трансплантаций почки. Из них 11 570 были трупные и 5535 - от живого донора [1, 2]. Отдел здравоохранения и служба обеспечения органами и планирования трансплантаций США установил, что более 3000 новых пациентов еже­месячно добавляются в лист ожидания почечного трансплантата, и что в 2014 году 4270 пациентов умерли, ожидая пересадку. Таким образом, суще­ствует серьезная потребность развития новых те­рапевтических стратегий, которые позволили бы преодолеть данные проблемы.

Прогресс, достигнутый за последнее время в методологических подходах, основанных на ство­ловых клетках и достижениях тканевого инжини­ринга, привел к появлению новой стратегии реге­неративной медицины с целью лечения болезней почек.

Во-первых, возможность имитировать важ­ные этапы развития почки в культивированной среде показывает, что при некоторых условиях человеческие плюрипотентные стволовые клет­ки (чПСК) могут дифференцироваться in vitro в основные типы почечных клеток, повреждаю­щихся при патологии почек (например, подоциты и тубулярные клетки, и др.) [3, 4]. Во-вторых, по­являющиеся технологии, включающие децеллюляризацию/рецеллюляризацию и биопринтинг, стали революционными в области тканевого ин­жиниринга, открывая возможность создания та­кого комплексного трехмерного (3D) органа, как почка [5, 6].

В данном обзоре мы освещаем текущие до­стижения в стратегии регенеративной медицины по воссозданию почечной функции с основным фокусом на (а) направленную дифференцировку чПСК в клетки, подобные почечным, которые можно использовать для инжиниринга почки и (б) применение децеллюляризации/рецеллюляризации и технологии биопринтинга. Видится, что все эти методики являются многообещающи­ми стратегиями тканевого конструирования для биоинжиниринга почки, и здесь мы обсуждаем основные проблемы будущего осуществления этих многообещающих технологий в клиниче­ской практике (рисунок).

ЛЕЧЕНИЕ СТВОЛОВЫМИ КЛЕТКАМИ ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ПОЧКИ: ПРОБЛЕМЫ И ТЕКУЩЕЕ ПОЛОЖЕНИЕ ДЕЛ

Болезни почек являются значимой проблемой здравоохранения во всем мире [7-9]. Распростра­ненность и плохой прогноз болезней почек и ассо­циированных патологий показывают срочную не­обходимость не только развития терапевтических подходов, но и расширения нашего понимания по­тенциала почки к развитию и восстановлению, о со- бенно, генерации нефрона, его дифференцировки и способности к самовосстановлению. Интерес­но, что почка взрослого млекопитающего имеет способность после повреждения восстанавливать некоторые типы клеток, включая клеточные эле­менты тубулярных и эпителиальных клеток, но не структуры клубочка [10-12]. Вероятно, это проис­ходит путем пролиферации резидентных клеток при отсутствии популяции предшественников или вновь сформировавшихся мультилинейных структур - процесс, называющийся «клеточной регенерацией» [13]. До сих пор клеточную реге­нерацию традиционно оценивают путем просле­живания точного клеточного происхождения этих пролиферирующих клеток [12-14], в то время как популяция клеток-предшественников может быть идентифицирована по способности предполагае­мых клеток-кандидатов дифференцироваться во многих направлениях [15].

В отличие от других организмов, таких как аквариумная рыбка Данио рерио и насекомые, у которых формирование новых нефронов возника­ет за счет регенерации поврежденных, у млекопи­тающих формирование новых нефронов ограни­чено эмбриогенезом и заканчивается к моменту рождения [16].

ПЛЮРИПОТЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ (ПСК): ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ ИСТОЧНИК ДЛЯ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ

Уже в 1998 году было продемонстрировано, что плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) могут происходить из внутренней клеточной массы бла­стоциста эмбриона, превращаясь в эмбриональ­ную стволовую клетку (ЭСК) [17]. Человеческие ЭСК (чЭСК) стали новым объектом для изучения тканевого развития и моделирования заболеваний in vitro. С этого момента интенсивные исследова­ния были посвящены разработке надежного про­токола по дифференцировке чПСК с целью соз­дания функционирующих клеток, способных вос­станавливать утраченную в результате прогресси­рования дегенеративных болезней функцию. Тем не менее, молекулярные механизмы, вовлеченные в ограничение линий дифференцировки чПСК при формирования специализированных типов клеток, до сих пор находятся на стадии исследова­ния. Важно, что самым критичным препятствием для использования чПСК в клинической практике являются потребность в человеческих эмбрионах, что затрагивает этические вопросы, и отторжение тканей после трансплантации.

Существуют другие методы создания ПСК (чПСК) из соматических донорских клеток. Они включают различные способы клеточного репро­граммирования, в том числе перенос ядра сома­тической клетки в энуклеированную яйцеклетку [18], слияние с ПСК [19], воздействие низкомо­лекулярных химических веществ [20] и транс - дукция факторов репрограммирования [21]. В случаях переноса ядра соматической клетки и репрограммирования, опосредованного слияни­ем клеток, ядра соматических клеток помещают в тотипотентное или плюрипотентное окружение, соответственно [22].

С другой стороны - трансдукция факторов репрограммирования POU5F1 (POU домен класс 5 фактор транскрипции 1; также известный как октамер-связывающий протеин 3 или октамерсвязывающий протеин 4, ОСТ3/4), SRY (sex de­termining region Y, определяющий пол, регион хромосомы Y), box 2 (SOX2), Круппель (Kruppel) - подобный фактор 4 (KLF4) и онкоген миелоци- томатоза (c-MYC) [вместе относящиеся к OSKM (по первым буквам в названии факторов) или факторам Яманака] приводит к генерации ауто­совместимых индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК), которые совмещают потенциальные способности к самовосстановле­нию и дифференцировке при сравнении с чЭСК. Большинство первоначальных исследований по созданию иПСК пациента были основаны на ис­пользовании интегративных систем, чрезмерно экспрессирующих c-MYC и KLF4, два хорошо из­вестных онкогена [23, 24].

Для решения этих проблем разные лаборато­рии, включая нашу, проводили поиски различ­ных типов клеток, которые могли бы быть репро- граммированы при отсутствии двух онкогенных факторов, но при использовании преимуществ внутренних свойств выбранных донорских кле­ток (например, клетки, экспрессирующие отно­сительно высокий уровень любого из факторов Яманака, могут быть репрограммированы при от­сутствии этих специальных генов, так, например, невральные стволовые клетки при отсутствии SOX2). Исходя из этого, иПСК были успешно ге­нерированы при отсутствии KLF4 и/или c-MYC из кератиноцитов [24], стволовых клеток пупо­вины [25] и даже невральных стволовых клеток [26]. Хотя эти открытия показали возможность сокращения числа факторов для генерации иПСК, они по-прежнему были основаны на примене­нии интегративных систем, приводящих к не­желательным эффектам, касающимся случайной трансгенной инсерции (например, риск трансген­ной индукции после дифференцировки, неполное репрограммирование и др.). Очень быстро разные лаборатории по всему миру разработали новые методы для создания свободных от трансгенов иПСК [27-32], также внесли важные изменения в клеточные культуры (например матрицы/среды) для получения фидер-независимых человеческих иПСК (чиПСК) [33-35] и идентифицировали рас­творимые вещества, замещающие факторы Яманака для создания иПСК [20].

Вместе с этими важными трудностями в об­ласти получения иПСК были опубликованы ре­зультаты интенсивных исследований по созданию специфичных для пациента иПСК с последующей дифференцировкой в определенные виды ткани, поврежденные в результате прогрессирования бо­лезни, обеспечивая уникальный сценарий для мо­делирования болезни [36-41] и даже для подбора специфичных для пациента лекарств [42, 43].

Еще одна область, привлекающая большой ин­терес, это коррекция генетических заболеваний в пациент-специфичных иПСК в аспекте персона­лизированной медицины.

ПСК могут быть источником для исправления генома, так как они могут быть подвержены об­ширному спектру манипуляций с тканевой куль­турой (например выбор лекарства и экспансия клонов) с сохранением их плюрипотентности и стабильности генома [44]. Разными исследова­тельскими группами продемонстрированы гене­рирование и коррекция пациент-специфичных чиПСК [38, 39, 45-49]. Эти исследования по­казали функциональную коррекцию болезнь- ассоциированного фенотипа при дифференциров- ке пациент-специфичных чиПСК и даже открыли перспективы для скрининга элементов, восста­навливающих фенотип болезни [49, 50] - дости­жение, которое, как представляется, является пер­вым применением потенциала чиПСК в регенера­тивной медицине и здравоохранении [51].

ГЕНЕРИРОВАНИЕ ПОЧЕЧНЫХ КЛЕТОК ИЗ ПСК: МЕТОДОЛОГИИ, ОСНОВАННЫЕ НА ПСК, МОДЕЛИРУЮТ РАЗВИТИЕ ПОЧКИ И ЕЁЗАБОЛЕВАНИЯ

Почка состоит из тысяч нефронов, образую­щихся в ходе развития в результате реципрокного индуктивного взаимодействия между двумя раз­ными клеточными типами: клетками метанефральной мезенхимы (ММ) и мочеточникового зачатка (МЗ) [16]. ММ дифференцируется в раз­личные типы эпителиальных клеток почки (от клубочка до сегмента собирательных трубочек), а МЗ генерирует систему чашечек.

За последние несколько декад во многих рабо­тах определены условия культивирования для изо­ляции и распространения in vitro этих клеточных популяций, правда, с ограниченным успехом (об­зор в [13, 14, 52]). Альтернативной методологией для создания неограниченного количества клеток почечного типа является дифференцировка ПСК. В последние несколько лет независимые исследо­вательские группы, включая нашу, впервые опи­сали возможность создания различных почечных популяций из ПСК. Song и соавт. были первыми, кто сообщил о получении предшественников по- доцитов из чиПСК, которые были функциональ­ными и эффективно интегрированы в ткань мы­шиного метанефрия. Однако вопрос о том, какие из эмбриональных клеток-предшественников в ходе развития эквивалентны иПСК-незрелым по- доцитам SongX остается открытым [3].

Позднее в 2013 г. S.I. Мае и соавт. впервые диф­ференцировали монослой чЭСК в промежуточ­ную мезодерму (ПМ), эмбриональную ткань, ко­торая дает происхождение как ММ, так и МЗ [53]. С этой целью авторы создали разные репортерные линии чиПСК, в которых GFP был направлен в ген OSR-1 (Odd-skipped related 1 - ген, транзиторно экспрессируемый в промежуточной мезодерме в ходе эмбриогенеза). При специальных условиях клеточной культуры иПСК, дифференцированные из ПМ, показали свойства других типов зрелых почечных клеток и ограниченных канальцевых структур. Интересно, что те же авторы доби­лись получения химически определенной среды для получения иПСК из ПМ и недавно описали идентификацию двух ретиноид-подобных моле­кул, индуцирующих образование ПМ из иПСК. Именно в этих опытах авторы продемонстриро­вали, что в результате полученные из ПМ иПСК проявляли способность дифференцироваться во множество типов почечных клеток, также образуя 3D-структуру, подобную почечным канальцам в образцах органных культур ex vivo [54].

Аналогично наша группа впервые сообщила о возможности создания предшественников МЗ из клеток ПМ из чПСК и чиПСК, полученных от пациентов с поликистозной болезнью почек. Спу­стя 4 дня предшественники МЗ экспрессировали HOXB7, RET и GFRA1 в большей степени, чем маркеры ММ. Более того, когда МЗ-подобные чиПСК- клетки были культивированы совместно с диссоциированными клетками мышиного метанефрия Е11-5, образованные клетки включа­лись только в цитокератин 8 позитивные (+) МЗ- подобные структуры, предполагая индукцию коммитированных ПМ клеток МЗ линии ex vivo [55].

С другой стороны - группа Little’a разработала протокол по созданию хорошо изученных пред­шественников почечных клеток как из чПСК, так и чиПСК в ПМ через заднюю первичную полоску, из которой ПМ образуется в ходе развития. Авто­ры использовали собственную линию чПСК для мониторирования экспрессии MIXL1 (гена, транзиторно экспрессируемого в первичной полоске в ходе эмбриогенеза) путем включения GFP в локус MIXL1. Группа Little’a создала два разных прото­кола: один - для одновременной генерации дери­ватов ММ и МЗ и другой - для МЗ-клеток только из ПСК. Примечательно, что в этой работе ис­пользовали повторную агрегацию проб для опре­деления потенциала дифференцировки почечно­подобных генерированных клеток, показывая, что повторно агрегированные дифференцированные ПСК могут одни организовать и генерировать нефрон-подобные структуры [56].

Ранее Lam и соавт. опубликовали быстрый и эффективный протокол дифференцировки для по­лучения PAX2+LHX1+ ПМ-клеток из чПСК, ко­торые спонтанно формировали каналец-подобные структуры. Интересно, что Lam удалось показать, что PAX2+LHX1+ ПМ-клетки из чПСК интегри­ровались в мышиную культуру метанефрия и дифференцировались в мультипотентные стволо­вые клетки-предшественники нефрона (СКПН) мезенхимы, экспрессируя маркеры SIX2, SALL1 и WT1 [57]. Таким же образом Taguchi и соавт. также показали, что возможно получать СКПН, которые обладают потенциалом реконструирова­ния 3D-нефрон-подобной структуры, содержащей как гломеруло-, так и тубуло-подобные структуры при совместном культивировании in vitro с эм­бриональным спинным мозгом из мышиных ЭСК и чиПСК [58]. В этой же работе Taguchi и соавт использовали модели мышиных линий in vivo и изучали разные стадии развития СКПН у мышей с геном-репортером OSR-1-GFP и выявили, что популяция OSR-1-GFP-Integrina+PDGFRa имеет самый высокий потенциал формирования нефро- нов in vitro. Таким образом, авторы пересмотре­ли пространственную и временную локализацию предшественников нефрона метанефрия in vivo, демонстрируя, что ПМ содержит, по крайней мере, две субпопуляции предшественников метанефрия - передний и задний домены, и что ПМ, расположенный сзади, дает рост линиям ММ [58]. Интересно, что эта последняя работа продемон­стрировала, в какой момент времени зарождаю­щаяся мезодерма становится ПМ и как она ста­новится специфичной для ММ- и МЗ-линий [58].

Интересно, что Imberti и соавт. получили по­чечные клетки-предшественники из чиПСК, сле­дуя двухэтапному протоколу, где сначала чиПСК подвергают воздействию ретиноевой кислотой, ингибиторами в RhpA и PI3K и активином А, ин­дуцируя развитие ПМ. Далее чиПСК, полученные из ПМ, в течение следующих 13 дней были под­вергнуты воздействию FGF2, BMP7 и глиального нейротрофического фактора (GDNF) для созда­ния чиПСК из ММ. Хотя другие авторы уже про­демонстрировали возможность генерации чПСК из ММ, в этой работе Imberti и соавт. впервые по­казали, что чиПСК - предшественники почечных клеток - надежно внедряются в поврежденные ка­нальцы, восстанавливая почечную функцию [59].

Недавно Morizane и соавт. показали возмож­ность развития СКПН из чПСК. Работа Morizane элегантно демонстрирует, что возможно воспро­извести ММ почку in vitro и генерировать SIX2+- SALL1+WT1+PAX2+ СКПН с 90% эффективно­стью через 9 дней. Более важно, что авторы дока­зали, что СКПН формируют почечный органоид как в 2D-, так и в 3D-образцах после 21-28 дней, содержащий эпителиальные нефрон-подобные структуры, экспрессирующие маркеры подоцитов (PODXL, NPHS1), проксимальных каналь­цев (CDH2, LTL), петли Генле (CDH1, UMOD) и дистальных канальцев (CDH1, BRN1), копи­руя развитие нефрона. Важно, что для изучения механизмов токсичности проксимальных и/или дистальных канальцев при воздействии на по­чечный органоид химических агентов, рутин­но применяемым на животных моделях in vivo, была использована система культуры органои­дов [60]. Подобным же образом Fredman и со­авт. показали, что почечные стволовые клетки, полученные из чПСК- сфероидов, легко могут произвести почечные органоиды, воспроизводя ткань-специфичную эпителиальную физиологию. В частности, авторы смогли выключить гены подокаликсина, PKD1 (полицистин-1) или PKD2 (полицистин-2) с помощью технологии коротких палиндромных повторов, регулярно расположен­ных группами (CRISPR)/CAS9 с направляющей РНК CRISPR/Cas9, впервые доказав осуществи­мость создания 3D-почечной структуры для моде­лирования болезней почек человека [61]. Совсем недавно Takasato и соавт. [62] сделали еще один шаг для создания почечного органоида, содержа­щего индивидуальные нефроны, далее разделяю­щиеся на дистальные и проксимальные канальцы, начальную петлю Генле и клубочки, содержащие подоциты с развивающимися ножковыми отрост­ками и проходящие васкуляризацию. Также как Freedman и соавт. [61], Takasato и соавт. показа­ли, что проксимальные канальцы аккумулирова­ли декстран и дифференцированно подвергались апоптозу в ответ на цисплатину [62].

Хотя эти работы показали возможность соз­дания различных почечных популяций из чПСК, они до сих пор различаются в отношении при­меняемых реагентов, их концентраций и време­ни выдерживания (табл. 1). Важно отметить, что разные данные по дифференцировке ПСК в клет­ки почечных линий демонстрируют, что мы еще далеки от выделения генов маркеров или поверх­ностных протеинов, определяющих разные ПМ популяции, выявленные у мышей [58].

ТЕХНОЛОГИИ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА

За последнее время появились как потенциаль­ные средства для редактирования генома в чиПСК пациента вместе с CRISPR/Cas9, разные плат­формы по редактированию гена для увеличения гомологичной рекомбинантной эффективности, в частности ДНК-нуклеазы (цинк-содержащие нуклеазы, TAL эффекторные нуклеазы и мегануклеазы) [44]. В общем, ДНК-нуклеазы и CRISPR/ Cas9-технологии позволяют выполнять различ­ные манипуляции с геномом сайт-специфичным способом, например, активацию /инактивацию гена, удаление последовательности, замену эле­ментов и хромосомную перестройку [44, 63]. В контексте моделирования заболеваний почек CRISPR/Cas9-технология была использована для получения 3D-почечных структур из чиПСК для выключения генов PKD1 (полицистин-1) и PKD2 (полицистин-2), приводя к возможности моделирования поликистозной болезни почек в 3D-образце, похожей на компартмент почечного эпителия [61].

Помимо огромного влияния на моделирование заболеваний человека платформ геномного редак­тирования, недавно исследованы другие аспекты, включая использование таких технологий для генерации ПСК репортерных клеточных линий [64-67]. Недавно группа Little’a разработала но­вый протокол по созданию самоорганизующихся почечных органоидов из чПСК, эквивалентных почкам человеческого плода в течение первого триместра гестации [62]. Эти результаты выяви­ли, что мы, с одной стороны, до сих пор далеки от развития зрелых почечных клеток, имеющих терапевтический потенциал, подразумевая, что новые стратегии должны быть приняты во вни­мание для развитяи зрелых почечных клеток для клинического применения (например, использо­вание кондиционированной культуры медии из почечных эмбриональных клеток, использова­ние систем реаггрегации совмещенных культур с клетками плода человека и пр.). С другой сторо­ны - профиль экспрессии мРНК в работе Little и соавт. происходит из различных клеточных типов, самоорганизующихся в почечную 3D-структуру, затрудняя анализ молекулярных путей, обеспечи­вающих почечную дифференцировку из различ­ных индивидуальных клеточных типов, состав­ляющих почечный органоид. С этой точки зрения технологии редактирования генома, в частности система CRISPR/Cas, могут помочь создать линии человеческих репортерных ПСК для детально­го выявления молекулярных сигналов почечной дифференцировки и, таким образом, пригодных для выявления зрелости генерированных клеток в сравнении с их двойниками in vitro из развиваю­щихся эмбрионов.

До сих пор почечные линии репортерных ПСК генерировали путем искусственной бактериаль­ной векторной хромосомы [53] и лентивируса [56]. Эти плодотворные исследования открыли пригодность линий репортерных клеток для иден­тификации и размножения требуемых типов по­чечных клеток (т.е. ПМ-клетки и клетки прими­тивной полоски) в ходе начала дифференцировки. Важно отметить, что группа Osafune сделала дальнейший шаг в применении OSR-1-GFP ген-репортерных клеточных линий и выявила два агониста рецепто­ра ретиноевой кислоты, а именно АМ580 и TTNPB, которые вместе с CHTR 99021 индуцировали дифференцировку ПМ- клеток путем активации экспрессии КМП4 [54]. Интересно, что новый метод дифференцировки, использующий малые составляющие, обеспечил менее доро­гой и более совместимый метод генера­ции ПМ-клеток по сравнению с методом применения фактора роста, описанный этой же группой ранее [53]. Поскольку идентификация и размножение ткань- специфичных почечных стволовых кле- ток/клеток-предшественников с нефрогенным потенциалом являются критич­ным шагом в развитии клеточной терапии для заболеваний почек, применение по­чечного репортера ПСК может привести к разработке условий клеточного культи­вирования для получения 3D-почечной структуры из чПСК.

НОВЫЕ СТРАТЕГИИ БИОИНЖИНИРИНГА ПОЧКИ

В области тканевого инжиниринга применяют принципы биологии и инжи­ниринга для разработки функциональ­ного замещения поврежденной ткани [68]. Десятилетиями исследователи на­пряженно работали для создания техник и методик для разработки биоостова, ис­пользуя натуральные или синтетические биоматериалы [69, 70]. Общее мнение в данной области таково, что для успешно­го применения в тканевом инжиниринге такой остов должен обладать нескольки­ми ключевыми характеристиками с целью поддержания правильного формирования ткани и функции: (а) быть биосовместимым; (б) обладать достаточной механи­ческой силой; (в) быть биоактивным для изменения 3D-клеточного микроокруже­ния и (г) обеспечивать диффузию пита­тельных веществ и очищение от токсич­ных продуктов. В этой области произош­ли значительные достижения, включая успешное создание трансплантатов та­ких тканей, как кожа [71], хрящ [72, 73], кость [74], мочевой пузырь [75], сосуды [76] и трахея [77]. Однако в наше время иссле­дователи стоят лицом к лицу с новой проблемой, относящейся к биоинжинирингу более сложных 3D-органов: легкие, печень, сердце и почки.

Сложные органы требуют интактной сосуди­стой сети, которая далее могла бы быть включена в систему циркуляции после трансплантации ре­ципиенту для обеспечения адекватного питания и кислородной поддержки всему органу. Более того, такие органы обычно обладают высокоорганизо­ванными орган-специфичными многоклеточны­ми структурами, ответственными за выполнение основных функций. Почка представляет собой один из наиболее сложных органов в отношении развития, пространственной организации и кле­точной специализации. Почка человека состо­ит из более чем 30 разных типов клеток и тысяч сложных и функционально разделенных эпители­альных структур, называемых нефронами, кото­рые являются функциональной единицей почки. Каждый нефрон дифференцируется из разных регионов, главным образом из капсулы Боумена, которая окружает клубочек, и почечных каналь­цев, каждый из которых имеет различные анато­мические характеристики и физиологичную роль [16]. Такая сложная органная структура не может быть воспроизведена при использовании тради­ционных методик тканевого инжиниринга остова.

Недавнее получение остова орган-специфичного экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) путем децеллюляризации/рецеллюляризации и возмож­ность точного расположения клеток и материалов путем технологии 3D-биопринтинга представля­ются двумя наиболее обещающими достижения­ми органного биоинжиниринга.

СОЗДАНИЕ ОРГАННЫХ ОСТОВОВ ПУТЕМ ТЕХНОЛОГИИ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ/ РЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ

Децеллюляризация целого органа открывает новые перспективы в тканевом инжиниринге [78]. Несколькоми лабораториями было сообщено о создании почечного остова от грызунов [79-85], свиней [86-88], макак-резус [89] и человеческих почек [5, 90, 91] (табл. 2).

Описано много протоколов децеллюляризации (см. [92-94]), которые обычно включают антеградную перфузию очищающих веществ (детер­гентов), ферментов и других разрушающих клет­ки растворов через сосудистую систему органа для удаления клеточных компонентов, в то же время сохраняя 3D-архитектонику и биохимиче­ский состав нативного ЭЦМ.

После децеллюляризации почечный остов со­храняет гломерулярную и тубулярную архитек­тонику и сосудистую сеть. Интересно, что неко­торые исследования открыли важную роль по­чечного ЭЦМ в управлении поведением клетки. Nakayama и соавт. показали, что чЭСК, подсажен­ные в ЭЦМ децеллюляризованной почки макакрезус, формировали канальцы и экспрессировали ряд специфичных для почки маркеров, но эти со­бытия не происходили, когда использовали ЭЦМ легкого, показывая определенную специфичность функций почечного ЭЦМ [95]. Действительно, в недавней публикации O’Neill и соавт. [96] было описано, что полученные из сосочка почечные стволовые клетки регулируются по-разному при культивировании в контакте с разными регионами ЭЦМ почки, предполагая регион-специфичный эффект ЭЦМ почки на поведение стволовых кле­ток. Более того, в недавнем исследовании Yu и соавт. [97] бесклеточный ЭЦМ почечного остова крысы был пересажен в частично нефрэктомированные почки крысы и показал некоторое возоб­новление роста удаленной области спустя 4 нед после трансплантации. Интересно, что микро­скопический анализ показал миграцию нестинпозитивных клеток из поврежденной почки в трансплантированный бесклеточный остов, де­монстрируя, что интактный бесклеточный почеч­ный остов сохраняет биоактивные сигналы. Одна­ко ни одного значимого восстановления почечной функции показано не было. В общем, эти работы поддерживают идею, что бесклеточный почечный ЭЦМ сохраняет ренальные специфичные биохи­мические и биофизические сигналы, которые спо­собны регулировать клеточную пролиферацию и дифференцировку. Хотя лежащие в основе ме­ханизмы еще должны быть изучены, эти данные предполагают, что ЭЦМ остова органа, получен­ный путем децеллюляризации, мог бы быть иде­альной системой для обеспечения клеткам необ­ходимого орган-специфичного микроокружения для создания функционирующих почек.

Несмотря на эти впечатляющие данные, ко­личество исследований, продемонстрировавших успешную трансплантацию целиком рецеллю- ляризированных почек, ограничено [80, 83-85, 87]. Одно из главных препятствий до настояще­го времени - это необходимость эффективно реэндотелизировать сосудистую сеть созданной почки перед имплантацией для того, чтобы избе­жать массивных тромбозов при соединении с со­судистой системой реципиента. Orlando и соавт. [87] имплантировали децеллюляризированный почечный остов свиньи в животное-реципиента, поддерживая достаточное кровяное давление в течение операции; однако в отсроченном периоде, составившем 2 нед, авторы доложили о массив­ных тромбозах, подчеркнув факт того, что эндоте- лизация сосудистой системы остова является ре­шающим требованием для проведения успешной пересадки и длительной жизни трансплантата. Peloso и соавт. [84] также наблюдали ту же пробле­му формирования тромбов при имплантации децеллюляризированного почечного остова крысам. Примечательно, что в исследовании, проведенном Ott [80], целиком бесклеточные почки крыс были рецеллюляризированы почечными клетками но­ворожденной крысы и клетками эндотелия пу­почной вены человека и далее имплантированы ортотопически, что привело к некоторому восста­новлению почечной фильтрации и реабсорбции. В этой важной концептуальной работе не было выявлено признаков кровотечения или образова­ния тромба в течение процесса имплантации, до­казывая важность реэндотелизации сосудистой сети бесклеточного остова. Все эти работы под­тверждают, что ортотопическая трансплантация почечного остова в наши дни технически возмож­на, и что надлежащая рецеллюляризация таких остовов необходима для последующего достиже­ния эффективной трансплантации и функциони­рования органа.

Оптимальный источник клеток для внедрения в бесклеточный почечный остов - это другой не­решенный вопрос. В настоящее время исследова­тели стараются рецеллюляризировать почечный остов с помощью различных клеточных источ­ников, включая почечные клетки новорожденных [80], эндотелиальные клетки пупочной вены чело­века [80], мышиные ЭСК [82, 85], эндотелиальные клетки из чиПСК [83], иммортализованные клетки почечного кортикального эпителия человека [83], линию клеток карциномы поджелудочной желе­зы человека [84] и первичные почечные клетки свиньи [98]. Учитывая последние достижения в технологиях иПСК и генного редактирования, а также самый последний прогресс в разработке протоколов для ренальной дифференцировки ПСК в надлежащие типы почечных клеток, представ­ляется, что ПСК-почечные клетки будут идеаль­ным источником для создания целого органа (что обсуждается выше в разделе терапия стволовы­ми клетками для регенерации почки). Считается, что предшественники почечных клеток из ПСК- клеток будут подходить для биоинжиниринга почки в большей степени, чем зрелые фенотипы почечных. Тем не менее, большой объем работы еще предстоит выполнить, чтобы точно охаракте­ризовать и признать пригодными популяции кле­ток из ПСК в отношении клеточной идентичности, дифференцировки и финального созревания для обеспечения надлежащей репопуляции различных почечных отделов, а также выполнения необходи­мых физиологических функции почки.

В текущих работах обычно используют почеч­ную артерию [79-82, 99] или мочеточник [79, 80] в качестве пути доставки клеток в почечный остов. Однако выбор пути для клеточного осеменения должен быть изучен в большей степени, учитывая, что различные биохимические и биофизические сигналы от различных отделов ЭЦМ могут влиять на клеточную пролиферацию, дифференцировку и дальнейшее созревание, как предполагается не­которыми исследованиями [95, 96]. В настоящий момент для доставки клеток в почечный остов и обеспечения стандартной доставки питательных веществ и кислорода в рецеллюляризированный почечный остов используют самодельные биоре­акторы. Song и соавт. [80] разработали биореак­тор, который позволяет осуществлять перфузию как через почечную артерию, так и мочеточник, включая порт для забора воздуха для генерирова­ния среды отрицательного давления и создания трансренального градиента давления, который улучшает прохождение клеток через мочеточник. Однако, до сих пор главной проблемой остается неравномерное распределение клеток, обычно на­блюдаемое после осеменения, с неспособностью клеток в ряде случаев достичь клубочка и, как правило, неэффективность формирования клеточ­ной плотности, сравнимой с нативным органом. Поэтому дальнейшая оптимизация систем биоре­актора будет необходима для достижения полной рецеллюляризации и созревания органа перед им­плантацией [100].

В целом возможность совмещения бесклеточного почечного ЭЦМ остова с почечными клетками из чиПСК является уникальной технологической платформой для инжиниринга почки [101]. В не­скольких статьях уже показана возможность при­менения технологии децеллюляризации к почкам человека [5, 90, 91], хотя ни в одном из этих иссле­дований не изучали рецеллюляризацию. Будущие направления потребуют определения оптимальных условий рецеллюляризации (клеточная плотность, путь доставки клеток и методика осеменения) с це­лью улучшения клеточной плотности, распределе­ния и задержки в различных областях бесклеточного почечного остова. Более того, расширение технологии рецеллюляризирования почечного остова человека потребует улучшения протоколов по кле­точной дифференцировке, стратегий эффективной доставки клеток и инновационных систем биоре­акторов с физиологически необходимыми условия­ми клеточных культур (объем, давление, скорость потока и механические стимулы) с целью создания функционирующей человеческой почки [100, 102].

3D-БИОПРИНТИНГ

SD-биопринтинг использует последние раз­работки в прикладных производственных техно­логиях (также известный как SD-принтинг) по тщательному депонированию живых клеток или клеточных масс вместе с поддерживающим био­материалом на основе гидрогеля (вместе называе­мыми биочернилами) для точной геометрии при построении орган-подобных или тканевых струк­тур в трех измерениях [103, 104]. В последние годы были сделаны новые достижения в разработ­ке различных техник биопринтинга для создания 3D-тканеподобной живой структуры (см. в [6]), включая базирующиеся на инжекторном клеточ­ном принтинге, экструзии, мягкой литографии и лазер-индуцированном переносе. Все они содер­жат компьютерное устройство, которое транс­лирует в трех измерениях сложную геометрию с целью повторения специфических биологических признаков ткани или даже целого органа.

Несмотря на огромный потенциал этой техно­логии в области тканевого инжиниринга, одним из главных препятствий, требующих решения в первую очередь, остается недостаток адекватного биоматериала для успешного биопринтинга жи­вых структур.

Много исследований проводятся в этой об­ласти для разработки новых классов биочернил, что полноценно освещено в других источниках [105-107]. Интересно, что в недавней работе Pati и соавт. [108] были изготовлены биочернила из децеллюляризированных жировой, хрящевой и сердечной тканей и использованы для принтинга нагруженных клетками конструкции с регули­руемой пористостью. Авторы продемонстриро­вали возможность создания тканевых аналогов in vitro как с адипогенным, так и хондрогенным потенциалом, показав стволовые клетки из че­ловеческой жировой ткани и мезенхимальные стволовые клетки из ткани нижней носовой рако­вины человека, напечатанные при использовании ЭЦМ-биочернил, полученных из жировой ткани и хрящевой ткани соответственно. В контексте регенерации почки успешное создание функцио­нального почечного остова путем биопринтинга будет ограничено возможностью повторения ренального ЭЦМ в отношении композиции и про­странственной организации, как и депонирования различных популяций почечных клеток органи­зованным образом. В связи с этим биочернила, полученные из бесклеточного почечного ЭЦМ, станут привлекательным материалов, так как это может обеспечить реноспецифичные внутриструктурные сигналы для напечатанных клеток.

Хотя технология 3D-биопринтинга пока толь­ко в самом раннем периоде развития, уже показан ее потенциал в создании органов. Группа Atala смогла смоделировать напечатанный мочевой пу­зырь, используя модифицированную технологию инжекторного биопринтинга [109], показав, что возможно печатать различные типы клеток в орга­низованной 3D-структуре. Эта оригинальная ра­бота открыла новые перспективы в 3D-принтинге органа в целом. Такие достижения, как использо­вание тканевых сфероидов в качестве строитель­ных блоков, продемонстрировали большой успех в создании микротканей, например, сосудистой сети [110, 111], которые в дальнейшем могут быть объединены в организованную макроткань.

Хотя большой объем работы еще должен быть проделан перед тем как полностью функциони­рующая почка сможет быть напечатана, предва­рительным шагом будет создание мелких орга­ноидов или функциональных единиц, таких как нефрон, которые будут полезны для применения при лекарственном скрининге и моделировании заболеваний. Уже некоторые работы исследуют применение чПСК в биопринтинге [112, 113] для изучения возможных эффектов параметров про­цесса биопринтинга на жизнеспособность клетки и потенциал дифференцировки.

В отношении инжиниринга целого органа не­сколько проблем должны быть приняты во вни­мание для реализации этой техники [103, 104]: а) разработка новых биочернил (т.е. ткань спец­ифичных биочернил); б) улучшение устройств биопринтинга с достаточным пространствен­ным разрешением для копирования иерархичной структуры сложного органа и сложности клеток органа; с) необходимость васкуляризации; д) раз­работка адаптированной перфузии биореакторов, подходящих для биопринтинга и дальнейшего со­зревания органа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Последние три года оказались впечатляющими в области инжиниринга почечной ткани.

Недавние работы демонстрируют осуществи­мость не только создания почечных клеток из пациент-специфичных иПСК, но и понимание сигналов, управляющих их образованием in vitro. Обнаруженные различия в данных указывают, что образованные почечные SD-структуры при ком­бинации почечных дифференцированных клеток из чПСК имеют различную степень функциональ­ного потенциала. Таким образом, предполагается, что необходимо развивать в дальнейшем мето­дики in vivo, доказывающие функциональность созданных из иПСК пациента почечных клеток, например, их трансплантация в нефрэктомически поврежденную почку на мышиных моделях. Кро­ме того, необходимо понимать, какие молекуляр­ные компоненты определяют почечную идентич­ность в ходе развития у человека, а создание ре­портерных ПСК для почечных маркеров являются необходимыми для всестороннего анализа разви­тия почки, приводя к разработке новых протоко­лов для формирования зрелых и функциональных почечных клеток.

Другая проблема, относящаяся к инжинирингу почки, касается разработки инновационных мето­дов, позволяющих имитировать такую сложную структуру органа. Недавно две разные стратегии привлекли внимание ученых - инжиниринг цело­го органа путем децеллюляризации/рецеллюляризации и биопринтинг живых орган-подобных структур, что могло бы стать новым источником органного обеспечения.

В заключение, продолжающиеся исследова­ния в области регенеративной медицины будут напрямую способствовать созданию новых стра­тегий биоинжиниринга почки: от производства биоостова и SD-живых структур до продукции по­чечных клеток из иПСК пациента в клинической практике.