ЭНДОТОКСИН И ХРОНИЧЕСКОЕ ВОСПАЛЕНИЕ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ ПОЧЕК

Согласно прошлому отчету Российского диа­лизного общества [1], на начало 2014 года заме­стительную почечную терапию получали 35 305 человек по все России, из них 28 440 больных по­лучали различные варианты диализа. Ежегодный прирост пациентов с 5 стадией хронической бо­лезни почек составляет более 7300 человек. При этом, это лишь «верхушка айсберга», поскольку данный отчет не охватывает больных на додиализных стадиях. Все это позволяет оценить мас­штаб проблемы. Несмотря на то, что в настоящее время уремия редко является непосредственной причиной смерти больных, хроническая болезнь почек занимает важное место в структуре ле­тальности, поскольку по мере прогрессирования заболевания риск смерти увеличивается в не­сколько раз.

Эндотоксин или липополисахарид (ЛПС) грамотрицательных бактерий - универсальный фактор патогенеза множества заболеваний. ЛПС является одним из сильнейших пирогенов и спо­собен инициировать системную воспалительную реакцию. Хроническое воспаление низкой степе­ни, свойственное больным с хронической болез­нью почек, порождает множественные нарушения гомеостаза, повышает риск развития сердечно­сосудистых осложнений и ухудшает прогноз вы­живаемости [2, 3].

Структура и биологическое действие липополисахарида.

Изучение строения ЛПС, а также путей реали­зации его биологического действия может быть полезно для разработки лечебных и профилакти­ческих мер.

Richard Pfeiffer в 1892 году открыл эндоток­син - термостойкий бактериальный яд и впослед­ствии сформулировал основные положения кон­цепции биологического действия эндотоксина.

Молекула ЛПС представляет собой облигатный компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Структурно ЛПС состоит из липида А, который представлен цепями жирной кислоты и консервативного полисахаридного ядра, к сердце­вине ядра прикреплена вариабельная углеводная цепочка - О-антиген (рис. 1).

Основной сигнальный путь при взаимодей­ствии клеток организма-хозяина и эндотоксина реализуется через систему Toll-пободных рецеп­торов - TLR (Toll-like receptor), экспрессируемых моноцитами, дендритными клетками, тучными клетками, В-лимоцитами. Схема взаимодействия эндотоксина и TLR4 представлена на рис. 2.

Специфичным лигандом для TLR4 является эндотоксин. Для активации этого рецептора так­же необходимо наличие компонентов рецептор­ного комплекса: CD 14 и LBP (lipopolysaccharide binding protein), а также лимфоцитарного антиге­на-96 - молекулы MD-2. Взаимодействуя с транс­мембранным рецептором - TLR4-MD-2, комплекс эндотоксин-LBP-CD14 специфическим образом активирует мононуклеарные фагоциты, что со­провождается выделением цитокинов - ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-23, ИЛ-27, ФНОа и др.

После связывания лиганда разрывается ком­плекс со специфическим ингибитором - Tollip (Toll interacting protein), происходит актива­ция и связывание TIR-домена рецептора (Toll-interleukin-1 receptor) с различными комбина­циями домен-содержащих адаптерных белков. В зависимости от набора адаптерных белков акти­вируются определенные сигнальные пути и опо­средуется соответствующий транскрипторный ответ клетки. В прошлые годы было установлено, что различные внутриклеточные пути реакций, вызванные взаимодействием TLR4 и ЛПС, опо­средуют разные варианты транскрипторного от­вета клетки [6].

Эндотоксин оказывает прямое цитотоксиче- ское действие. Благодаря наличию гидрофобной части молекулы эндотоксин способен внедряться в двухслойную клеточную мембрану, способствуя ее реорганизации: изменению гидрофобности, по­верхностного заряда, функциональной стабиль­ности. Это приводит к нарушениям клеточного метаболизма: угнетению клеточного дыхания, нарушению функций митохондрий, ускорению окислительных процессов.

При проникновении в различные жидкие сре­ды организма эндотоксин, обладающий чрезвы­чайно высокой биологической активностью, при­водит к многочисленным патофизиологическим эффектам: активации системы коагуляции, ком­племента и клеток крови (моноцитов, макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов, базофилов), а также эндотелиоцитов. Развивается комплекс адаптаци­онных реакций, который выражается в активации как клеточного, так и гуморального иммунитета. Массивное выделение медиаторов клинически проявляется системной воспалительной реакцией [4, 7].

Известно, что эндотоксин является специфиче­ским активатором комплемента, в результате чего генерируются анафилотоксины - фракции С3а и С5а. Активация системы комплемента приводит к секреции базофилами биологически активных веществ: гистамина, серотонина, брадикинина. В результате происходят изменение тонуса гладкой мускулатуры и активация клеток эндотелия ка­пилляров, усиление сосудистой проницаемости. Фрагменты С3а и С5а комплемента способствуют хемотаксису, агрегации и дегрануляции клеток крови, что приводит к образованию свободных радикалов кислорода и дополнительному выделе­нию медиаторов [8, 9].

Известно, что инфекция способна активиро­вать коагуляцию крови. Во многом это обуслов­лено влиянием эндотоксина, который способен инициировать коагуляционный каскад напрямую. Эндотоксин вызывает повышенную экспрессию тканевого фактора на мембранах эндотелиоцитов, активирует фактор XII и ингибитор активатора плазминогена [9, 10].

Низкие концентрации ЛПС, выявленные в кро­ви у здоровых людей, позволяют рассматривать его как фактор, необходимый для нормального развития иммунной системы и облигатного фак­тора адаптационного синдрома. Физиологическая концентрация ЛПС в крови (выявленная при по­мощи ЛАЛ-теста) составляет до 1 EU/мл. С точки зрения группы отечественных авторов, активно занимающихся изучением данного вопроса, фи­зиологически контролируемое присутствие ЛПС в крови «обеспечивает поддержание активности жизненно важных систем организма на необходи­мом в данный момент времени уровне, поскольку эндотоксина является неспецифическим мульти- потентным активатором в силу своей способно­сти активировать протеинкиназу С, снимающую репрессию с генома» [7].

Доказана важная роль хронического воспале­ния, инициируемого ЛПС, в патогенезе атероскле­роза, бронхиальной астмы, псориаза, аллерги­ческой реакции. [7]. Помимо этого, повышенное содержание ЛПС в крови способствует прогрес­сированию инсулинрезистентности, метаболиче­ского синдрома, ожирения [11, 12].

При нарастании концентрации эндотоксина выше физиологической его эффекты многократ­но усиливаются, развивается системная воспали­тельная реакция. В результате комплекса адапта­ционных реакций, в которые вовлечены компле­мент, клетки крови (моноцитарные и зернистые лейкоциты), а также эндотелиоциты, активируют­ся клеточное и гуморальное звенья иммунитета.

Источники эндотоксина и методы оценки тяжести эндотоксинемии. Важность адекватной оценки тяжести эндотоксинемии у пациентов с хронической болезнью почек обусловлена рядом факторов. Известно, что для больных с ХБП свой­ствен повышенный уровень ЛПС в крови [3, 13]. Повышение концентрации эндотоксина, а также компонентов рецепторного комплекса TLR4 (рас­творимой формы CD 14, липополисахаридсвязывающего белка) в крови у больных как на додиализной стадии, так и у больных, получающих гемо- или перитонеальный диализ, связано с по­вышением риска развития сердечно-сосудистых осложнений и смерти [2, 13, 14, 15].

Основным источником эндогенного ЛПС яв­ляются грамотрицательные бактерии толстой кишки. Об этом свидетельствует, с одной сторо­ны, повышенное содержание ЛПС в крови во­ротной вены и лимфатических протоках толстого кишечника, обнаружение там фрагментов ДНК бактерий. У больных с хронической болезнью почек транслокация ЛПС из просвета кишечника в системную циркуляцию усиливается. Об этом косвенно свидетельствуют хронические воспали­тельные изменения стенки кишки, обнаруживае­мые при аутопсии. При этом тяжесть этих изме­нений и эндотоксинемии прямо коррелирует со снижением скорости клубочковой фильтрации. Изменению количественного и качественного со­става кишечного микробиома способствуют уре­мия, электролитные нарушения, особенности пи­тания и другие факторы [15].

При этом у данной категории больных, наряду с микробиомом толстой кишки, важным источ­ником ЛПС являются диализат [3] в результате наличия бактериальных биопленок в системе во­доочистки и магистралях [16], а также централь­ные венозные [15, 17] и перитонеальные катетеры [18]. Сложность и неоднозначность исследования последствий системной эндотоксинемии in vivo главным образом обусловлена сложностью опре­деления концентрации или активности (что в це­лом также косвенно отражает его концентрацию) эндотоксина в крови.

Самым распространенным тестом для выявле­ния и количественной оценки уровня эндотоксина в лекарственных препаратах и воде для ГД являет­ся LAL-тест (Limulus amebocyte lysate test) - реак­ция лизата амебоцитов с эндотоксином, в которой в результате каскада реакций сериновых протеаз формируется гель (течение реакции схоже с те­чением свертывания крови у млекопитающих). Сложности с определением концентрации ЛПС в крови связаны с особенностями проведения LAL-теста: в различных вариантах этого теста отмечается сильное влияние компонентов плаз­мы (ферментных систем, солей желчных кислот, липопротеинов и других белков), лекарственных препаратов (антибиотики, гепарин) и даже мем­бран диализаторов (целлюлозных) на результат. Активность ЛПС разных грамотрицательных бак­терий в LAL-тесте неоднородна. В связи с этим реакция организма и результатов LAL-теста не всегда тесно коррелируют. Помимо этого, отмеча­ется значительная неоднородность реактивов. [19, 20] Для стандартизации результатов было предло­жено выражать содержание эндотоксина не как абсолютную концентрацию, а в единицах эндо­токсина на 1 мл по отношению к контрольному стандартному эндотоксина E. coli [20].

Перспективным является вариант LAL-теста с применением светорассеивающего фотометра (endotoxin scattering photometry - ESP). Этот тест способен обнаруживать очень низкие концентра­ции ЛПС в крови и более информативен, чем клас­сический турбодиметрический LAL-тест [21].

Известен метод детекции ЛПС в препаратах и воде с применением рекомбинантного фактора свертывания С (фактора свертывания крови кра­бов семейства Limulidae) - внутриклеточной сериновой протеазы (проферемента), которая ини­циирует каскад коагуляции в ответ на эндотоксин. Каскад реакций в тесте короче, чем при класси­ческом LAL-тесте, метод более чувствителен и более стандартизирован. Тем не менее, пока нет сообщений о применении этого метода для обна­ружения ЛПС в крови [22].

Единственным одобренным методом для опре­деления эндотоксина в крови является исследо­вание активности эндотоксина (EAA - endotoxin activity assay) [23]. Однако и этот метод имеет два относительных недостатка: недостаточную информативность при низких концентрациях эн­дотоксина, а также этот тест выражает не непо­средственно концентрацию эндотоксина, а ин­дуцированную ЛПС кислородпродуцирующую способность нейтрофилов конкретного больного в присутствии специфических анти-ЛПС-антител [20], т.е. тест зависит еще и от активности нейтрофилов пациента.

В связи со сложностью детекции и количе­ственной оценки эндотоксинемии предложены другие, косвенные способы оценки. CD14 в рас­творимой или мембранной форме - необходимый компонент рецепторного комплекса при взаимо­действии клеток с ЛПС, причем концентрации этих молекул тесно коррелируют. Доказано, что уровень растворимой формы CD14 повышен у больных с ХБП, что ассоциировано с ростом ри­ска смерти с числом сердечно-сосудистых ослож­нений [24, 25]. Схожим суррогатным способом оценки тяжести эндотоксинемии у больных на ГД является уровень анти-ЛПС-антител классов IgA, M, G [13, 20].

Уровень эндотоксинемии выше, чем у здоро­вых людей, но все равно достаточно низок, и ЛПС может не выявляться рутинным методом иссле­дования, особенно в крови. При этом, тем не ме­нее, отмечается значимая корреляция с уровнем С-реактивного белка [2, 26]. Являясь суррогатным маркером системной эндотоксинемии, этот пока­затель недостаточно специфичен.

Методы борьбы с системной эндотоксинемией.

Существуют филогенетически сложившиеся системы инактивации эндотоксина. В норме боль­шая часть поступающего в кровь воротной вены эндотоксина разрушается в купферовских клетках печени и клетках ретикулоэндотелиальной систе­мы. Тем не менее, постоянное поступление повы­шенного количества ЛПС кровоток постепенно приводит к несостоятельности антиэндотоксиновых систем.

Предложены множество препаратов, которые должны блокировать биологическое действие эн­дотоксина: иммунизированная сыворотка [27-29], антиэндотоксиновые IgG и IgM [30], естествен­ные и рекомбинантные антимикробные пептиды [31], липосахаридсвязывающий протеин (есте­ственный акцептор эндотоксина в плазме кро­ви человека) [32], регуляторный белок системы комплемента С1-ингибитор [33], антилипополисахаридный пептид мечехвоста и синтетический антилипополисахаридный пептид [34], пептид М33 [31], антагонист эндотоксина E5564, химер­ные молекулы TLR4-Fc [35]. Однако на данный момент эти препараты так и не получили широ­кого распространения, а большинство из них не подтвердили свою клиническую эффективность. Известны работы, посвященные развитию эндотоксиновой толерантности. Ключевые роли в развитии толерантности отводят Toll-подобным рецепторам и их адаптерным белкам, а также ак­тивности транскрипционного фактора NF-κβ [36]. Помимо этого, описаны множество природных и синтетических рекомбинантных пептидов [37, 38], которые способны или непосредственно свя­зывать ЛПС, или ингибировать его биологическое действие. Однако пока не существует доступных в клинической практике способов снижения чув­ствительности к эндотоксину.

На состояние кишечного микробиома, как главного источника эндогенного ЛПС, оказывает влияние характер питания: изменение естествен­ной диеты, а также применение пробиотиков мо­жет снизить тяжесть системной эндотоксинемии [15, 39-42]. Помимо этого, доказано, что приме­нение фосфатбиндеров, в частности - севеламера, может оказывать протективный эффект, свя­зывая кишечный ЛПС (как in vitro, так и in vivo) и уменьшая его транслокацию через кишечную стенку, что сопровождается снижением активно­сти системного воспаления (концентрации рас­творимого CD14, С-реактивного белка, ИЛ-6), окислительного стресса, атерогенеза, дисфункции эндотелия (эндотелина-1, ингибитора-1 активато­ра плазминогена) [43, 44]. Помимо этого, норма­лизация микрофлоры кишечника может снизить продукцию уремических токсинов [45, 46].

Материалы, которые в меньшей степени под­вержены образованию биопленок - одного из основных источников экзогенного ЛПС, пред­ставлены: поливинилхлорид, хлорированный по­ливинилхлорид, поливинилиденфторид, сшитый полиэтилен, нержавеющая сталь, полипропилен, полиэтилен, акрилонитрил-бутадиен-стирол, по­литетрафторэтилен и др. Использование этих ма­териалов в системе водоподготовки может умень­шить контаминацию. Эффективными дезинфици­рующими средствами могут быть: гипохлорит на­трия, надуксусная кислота, формальдегид, озон, растворенный в горячей воде; перуксусная кисло­та и др. [47]. Также уменьшить содержание эндо­токсина в диализате может применение специаль­ных бактериальных и эндотоксиновых фильтров, сухих буферных бикарбонатных систем, а также организационные меры [48-51].

Мембраны, которые используются в диализо- торах, непрерывно эволюционируют. Известны сорбционные способности некоторых мембран, частности, полисульфона [52], AN69 [53], полиметилметакрилата [54]. Различные мембраны \ имеют способность к адсорбции эндотоксина, а также других молекул (в частности, компонентов комплемента, иммуноглобулинов, молекул оксидативного стресса, CD40, цитокинов и др.), при этом они имеют хорошую биосовместимость [55]. Однако сорбционная емкость таких мембран не­высока. Интересны исследования по применению комбинированных мембран - «мембран со сме­шанной матрицей», сочетающих в себе высокие диффузионно-сорбционные показатели [56, 57].

Имеются ряд работ, свидетельствующих, что гепарин обладает способностью дозозависимого ингибирования действия эндотоксина [58-63].

Заключение. Несмотря на то, что за последние годы установлена значительная роль эндотоксина в нормальной физиологии человека, инициируемая при его избытке хроническая воспалительная ре­акция лежит в основе множества патологических процессов у больных с хроническими заболевани­ями почек. Проблема системной эндотоксинемии пока не решена. Основные меры направлены как на борьбу с эндотоксинемией, так и на устранение ее последствий. Дальнейшее изучение данного во­проса позволит улучшить результаты лечения па­циентов с хронической болезнью почек.