ВЛИЯНИЕ ЭМПАГЛИФЛОЗИНА НА СОСТОЯНИЕ ПОЧЕК У НОРМОГЛИКЕМИЧЕСКИХ КРЫС С СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время в мире насчитывается при­мерно 387 млн страдающих сахарным диабетом (СД). При этом заболеваемость и распространен­ность СД непрерывно увеличиваются на протя­жении последних 20 лет [1]. Общеизвестно, что СД является тяжелым мультисистемным заболе­ванием, ассоциирующимся с наличием сердечно­сосудистых проявлений, в том числе поражений коронарных, цереброваскулярных и перифериче­ских артерий. Последнее во многом определяет летальность у больных с СД. Кроме того, при СД возникают тяжелые повреждения почек и моче­выводящих путей [2]. В Западной Европе и США примерно у 40% всех пациентов, требующих регу­лярной диализной терапии, причиной терминаль­ной почечной недостаточности (ТПН) является СД [3]. В свою очередь, развитие ТПН определяется наличием при СД экстра- и интраренального ате­росклероза и диабет-ассоциированного поврежде­ния клубочков (диабетическая нефропатия - ДН). Кроме того, в почках у больных с СД часто наблю­дается выраженное интерстициальное воспаление [4]. Наконец, пациенты-диабетики составляют группу высокого риска в отношении контрастиндуцированного острого повреждения почек (КИ-ОПП). Они же часто страдают от бактериаль­ных инфекций мочевых путей, иногда приводящих к поражениям почечной ткани как таковой [5].

Мультисистемность СД требует терапевти­ческих подходов и лекарственных препаратов, способных оказывать плейотропные воздействия [6-8]. Например, желательно, чтобы антигипер- гликемические препараты оказывали прямое, кардио- и(или) нефропротекторное воздействия [9].

В настоящее время класс сахароснижающих средств непрерывно пополняется не только от­дельными препаратами, но и целыми группами лекарств, зачастую обладающими принципиально новыми механизмами действия. Очень интерес­ными в данном аспекте представляются конку­рентные ингибиторы мембранного натрий/глю- козного котранспортера SGLT-2.

Несколько крупных рандомизированных ис­следований, результаты которых суммированы в ряде недавних обзоров, дали важную информа­цию о последствиях применения ингибиторов SGLT-2 у пациентов с сахарным диабетом. В этих работах получены согласующиеся результаты, подтверждающие, что назначение ингибиторов SGLT-2 приводит к редукции гипергликемии, улучшает гликемический контроль, ассоциирует­ся со снижением массы тела, вызванной нарас­танием экскреции глюкозы, и уменьшением артериального давления. Такие эффекты имели место при использовании ингибиторов SGLT-2 как в виде монотерапии, так и в комплексе с другими противогликемическими средствами [6-8, 10]. Отчетливое кардиопротективное действие инги­биторов SGLT-2 у больных с сахарным диабетом выражалось в снижении смертности от кардио­васкулярных причин, числа госпитализаций по поводу сердечной недостаточности и уменьше­нии общей смертности. В плане нефропротекции применение данных препаратов ассоциировалось с существенным снижением частоты развития новых случаев диабетической нефропатии или ухудшения течения уже существующей. Исполь­зование SGLT-2 противодействовало также до­стижению таких композитных конечных точек, как удвоение концентрации сывороточного креатинина, начало заместительной почечной терапии или смерть от почечных причин. Кроме того, ре­зультаты экспериментальных и клинических ис­следований свидетельствуют о том, что данные средства способны снижать степень гломеруляр­ной гиперфильтрации, уменьшать альбуминурию и выраженность почечной гипертрофии и воспа­ления [6-10].

Имеющиеся данные не оставляют сомнений в том, что ингибиторы SGLT-2 обладают целым ря­дом позитивных плейотропных терапевтических эффектов, однако далеко не все вопросы относи­тельно последствий их применения (в том числе в плане кардио- и, особенно, нефропротекции) остаются разрешенными. В частности, не извест­ны многие конкретные механизмы воздействия этих средств на сердечно-сосудистую систему и почки. Кроме того, большинство исследований, подтвердивших нефро- и кардиопротективное действия ингибиторов SGLT-2, выполнены на пациентах с сахарным диабетом или эксперимен­тальных моделях данного заболевания. В такой ситуации нефро- и кардиопротективные эффек­ты данных препаратов могли быть следствием их метаболического (антигипергликемического) действия. Собственное же влияние ингибиторов SGLT-2 на сердечно-сосудистую систему и поч­ки может оказаться замаскированным. В связи с этим мы предприняли настоящее исследование, в котором изучали потенциальные нефро- и кардиопротекторные эффекты ингибитора SGLT-2 эмпа­глифлозина у крыс линии Wistar c эксперимен­тальной сердечной недостаточностью. При этом данное сообщение посвящено, преимущественно, результатам воздействия эмпаглифлозина на со­стояние почек.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на взрослых крысах- самцах линии Wistar массой 190-210 г (n=21), раз­деленных с помощью рандомизации на две груп­пы. Хроническую сердечную недостаточность (ХСН) моделировали путем перманентного лиги­рования левой коронарной артерии [11]. Первую группу (группа интервенции) составили 11 крыс, у которых моделировали ХСН, и через 1 мес по­сле операции начинали лечение эмпаглифлозином («Джардинс®», «Берингер Ингельхайм») внутрь в дозе 1 мг/кг. Вторую группу (группа сравне­ния) составили 10 крыс с ХСН, не получавших лечения. Через 1 мес после операции оценивали эффективность модели эхокардиографическим методом, критериями успешности модели ХСН считали наличие участков истончения миокарда, нарушений локальной и/или глобальной сократи­мости левого желудочка (ЛЖ).

Животные получали стандартный пищевой ра­цион (0,34% NaCl). Доступ к воде был свободным.

Через 1 мес после начала лечения эмпаглиф- лозином у бодрствующих крыс измеряли систо­лическое АД манжеточным методом. Для этого животному, помещенному в индивидуальную ка­меру, на хвост надевали окклюзионную манжет­ку, соединенную с электроманометром «ENEMA» (Швеция). Уровень АД соответствовал величине давления в манжетке в момент прекращения пуль­совых колебаний. Каждому животному выполня­ли 4-5 замеров АД и частоты сердечных сокраще­ний (ЧСС) и рассчитывали среднее значение трех последних измерений.

На следующий день после измерения АД крыс помещали в метаболические клетки, в которых проводился сбор мочи в течение суток. измерял­ся объем мочи (V) и с помощью стандартных ла­бораторных анализаторов определялись мочевые концентрации натрия (UNa), глюкозы (UGlu), кальция (UCa), магния (UMg), неорганического фосфора (UPi), альбумина (UA), мочевины (UUr) и креатинина (UCr). Рассчитывались величины суточной экскреции (UX24, где Х - концентрация соответствующего вещества) этих веществ.

В образцах мочи также устанавливалась экс­прессия миРНК-21 при помощи реакции ампли­фикации (RealTime PCR-протокол). Расчет прово­дился по методу 2^deltaCt.

Статистический анализ выполнялся с помо­щью пакета прикладных программ STATISTICA 10. Результаты представлялись как медиана [ин- терквартильный размах]. Использованы тест Манна-Уитни и коэффициент ранговой корреля­ции Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Назначение эмпаглифлозина существенно не сказывалось на уровнях артериального давления (рис. 1А) или частоты сердечных сокращений (см. рис. 1Б).

При этом у крыс, получавших эмпаглифлозин, наблюдалось закономерное нарастание концен­трации глюкозы в моче (см. рис. 1В) и ее суточной экскреции (см. рис. 1Г).

Концентрация альбумина в моче у лаборатор­ных животных сравниваемых групп значимо не различалась (см. рис. 1Д). Между тем, суточная экскреция этого белка у крыс группы интервен­ции оказалась значимо большей (см. рис. 1Е).

Уровень экспрессии миРНК-21 в моче у крыс, получавших эмпаглифлозин, также был выше, чем у животных, не получавших препарат (см. рис. 1Ж).

Назначение эмпаглифлозина не приводило к существенным изменениям экскреции большин­ства изученных веществ, включая характеристики почечного выведения натрия (таблица). Интерес­но, однако, что и концентрация неорганического фосфора в моче и величина его суточной экскре­ции у крыс, получавших ингибитор SGLT-2, ока­зались значимо ниже, чем у животных группы сравнения (см. таблицу).

Концентрация глюкозы в моче прямо коррели­ровала с мочевой концентрацией альбумина (рис. 2А). Аналогичная связь отмечена между величи­нами суточной экскреции этих веществ (см. рис. 2Б). Выявлены также обратная корреляция между концентрацией альбумина в моче и диурезом (см. рис. 2В) и прямая связь первого параметра с уров­нем мочевой экспрессии миРНК-21 (см. рис. 2Г).

ОБСУЖДЕНИЕ

В нашем исследовании у крыс, получавших эмпаглифлозин, наблюдалось закономерное на­растание концентрации глюкозы в моче (см. рис. 1В) и ее суточной экскреции (см. рис. 1Г). Такой эффект, очевидно, определяется механизмом дей­ствия данного препарата.

С другой стороны - при воздействии эмпаглиф- лозина мы не отмечали нарастания экскреции на­трия (см. таблицу). Это может показаться несколь­ко неожиданным. Переносчики SGLT-2 и SGLT-1 являются котранспортерами, участвующими в ре­абсорбции не только глюкозы, но и натрия (при стехиометрии 1:1; на одну молекулу глюкозы пе­реносится 1 ион натрия). Поэтому подавление ак­тивности SGLT-2 за счет эмпаглифлозина должно снизить реабсорбцию натрия и, соответственно, увеличить его экскрецию. Такое, действительно, было показано в ряде экспериментальных [12] и клинических исследований [13]. Однако данный эффект отмечался только на ранних этапах приме­нения эмпаглифлозина. С течением времени экс­креция данного катиона при приеме и отсутствии приема ингибиторов SGLT-2 уравнивалась. В на­шей работе экскреция натрия измерялась через 1 мес после начала терапии эмпаглифлозином, что, по-видимому, является достаточным сроком для нивелировки натрийуретического эффекта препа­рата. На наш взгляд, отмеченный выше феномен не выглядит чем-то удивительным. Объяснением всех этих данных может быть то, что почки (и организм в целом) стремятся не допустить некон­тролируемых потерь натрия. Снижение реабсорб­ции данного катиона в одном месте (или за счет подавления одной транспортной системы, напри­мер, SGLT-2) приводит к реципрокному нараста­нию его всасывания в других отделах почечных канальцев или за счет активации других транс­портеров (в частности, NAPI-IIa - см. ниже).

Cуточная экскреция альбумина у крыс груп­пы интервенции оказалась значимо больше, чем у животных, не получавших эмпаглифлозин (см. рис. 1Е). Эти данные, вообще говоря, противо­речат результатам ряда клинических [14-17] и экспериментальных [18-21] исследований, в ко­торых обычно наблюдали уменьшение альбуми­нурии. Антиальбуминурический эффект инги­биторов SGLT-2 при СД обычно связывают с их способностью уменьшать гломерулярную гипер­фильтрацию, возникающую на ранних стадиях этого заболевания. Полагают, что при начальной гипергликемии возрастает фильтрационный за­ряд глюкозы (количество профильтровавшегося олигосахарида). В свою очередь, это активирует системы ее реабсорбции (SGLT-2 и SGLT-1), что дополнительно может приводить и к развитию ги­пертрофии проксимальных канальцев. Однако на­растание реабсорбции глюкозы, как уже указыва­лось выше, неизбежно ассоциируется и с ростом обратного всасывания натрия. Все это уменьша­ет доставку натрия, воды и, возможно, других веществ (хлора, калия) в нижележащие отделы нефрона, в том числе, к области плотного пятна (macula densa). В конечном итоге, это приводит к включению механизма канальце-клубочковой об­ратной связи и в данном случае преимуществен­ной афферентной вазодилатации с последующим ростом гломерулярного кровотока, внутриклубочкового гидростатического давления и развитием гиперфильтрации («тубулярная» гипотеза разви­тия гиперфильтрации при СД) [22,23]. Напротив, при применении ингибиторов SGLT-2 модифи­цируются патофизиологические процессы, со­гласующиеся с «тубулярной» гипотезой развития гиперфильтрации при СД. Эти препараты повы­шают поступление натрия к началу дистального извитого канальца, что вызывает усиление входа этого катиона в клетки плотного пятна с после­дующим усилением секреции АТФ и накопле­нием аденозина в интерстиции и экстрагломерулярных мезангиальных клетках, что в итоге обе­спечивает констрикцию приносящей артериолы. Афферентная вазоконстрикция, в свою очередь, приводит к уменьшению интрагломерулярного давления, гиперфильтрации и повреждения по­чек [22, 23]. Изученные нами животные не стра­дали СД. Поэтому нет оснований ожидать у них и наличия каких-либо проявлений гломерулярной гиперфильтрации. В таком случае нефропротектронный эффект эмпаглифлозина, связанный с его возможным вмешательством во внутриклубочковую гемодинамику, едва ли возможен. С другой стороны - наши данные не исключают того, что данный ингибитор SGLT-2 может оказывать опре­деленное неблагоприятное воздействие на почки, усиливая альбуминурию и, возможно, экспрессию микроРНК-21 (см. рис. 1Ж) - малой некодирую­щей регуляторной РНК, которая, по-видимому, является важным участником и свидетелем разви­тия повреждений почек [24-27].

Причины, по которым ингибиторы SGLT-2 могут способствовать развитию альбуминурии у исследованных нами животных, не ясны. Мы склонны полагать, что альбуминурия в данном случае носит тубулярный характер и связана с изменениями химического состава содержимого проксимальных канальцев. Во всяком случае, у экспериментальных животных обнаружены зна­чимые прямые связи между экскрецией глюкозы и альбумина (см. рис. 2А, Б).

У животных с СН, получавших эмпаглифлозин, отмечено снижение экскреции неорганиче­ского фосфора по сравнению с крысами, которым данный препарат не назначался (см. таблицу). Насколько нам известно, гипофосфатурический эффект ингибиторов SGLT-2 никем ранее не опи­сывался. Причины этого явления остаются неяс­ными. Однако необходимо иметь в виду следую­щее. Около 80% профильтровавшегося фосфата в условиях его обычного поступления с пищей реабсорбируется в начале извитой части прокси­мального канальца, главным образом, юкстамедуллярных нефронов [28, 29]. Иными словами, реабсорбция большей части фосфата происходит там же, где и основной массы глюкозы.

Всасывание фосфата опосредуется натрий- зависимыми котранспортерами для неорганиче­ского фосфата (Pi), локализованными в мембра­нах щеточной каймы.

Идентифицировано три представителя се­мейства Na+-зависимых котранспортеров типа II, кодирующихся семейством генов SLC34 [29]. SLC34A1 (NAPI-IIa) экспрессируется, главным образом, в почках и ответствен примерно за 70­80% общей реабсорбции фосфата [30]. Другой представитель этого семейства - SLC34A3 (NA- PI-IIc) также выявляется почти исключительно в почках [31]. SLC34A2 (NAPI-IIb) в основном экс­прессируется в тонком кишечнике, а также других органах: яичках, легких, печени и лактирующих молочных железах [32].

В почках также выявлены натрий-зависимые транспортеры фосфата, относящиеся к семейству SLC20. PIT-2 (SLC20A2) локализован в мембра­нах щеточной каймы проксимальных канальцев, тогда как точное место расположения PIT-1 в поч­ках неизвестно [33].

PIT-2 широко распространен в большинстве тканей. Его точная роль в ренальной реабсорбции фосфата в настоящее время не раскрыта. Однако у мышей с отсутствием обоих транспортеров NaPi- IIa и NaPi-IIc реабсорбция фосфата редуцируется более чем на 90%. Это может указывать на то, что вклад PIT-2 (и других возможных транспортеров фосфата) минимален [34].

Так или иначе, основные транспортеры для фосфата (NAPI-IIa) и глюкозы (SGLT-2) являются котранспортерами, участвующими в реабсорбции не только фосфора или глюкозы, но и натрия. Пода­вление активности SGLT-2 за счет эмпаглифлозина первоначально снижает и реабсорбцию натрия. Од­нако, как мы уже отмечали выше, такое нарастание экскреции натрия носит транзиторный характер [12, 13]. Это может быть связано с компенсаторной активацией других транспортеров, перемещающих натрий, в частности, NAPI-IIa. Конкретные меха­низмы активации фосфат-натриевых котранспортеров в данной ситуации неизвестны.

Существуют исследования, выполненные в основном в 80-90-х годах прошлого века, резуль­таты которых могут иметь косвенное отношение к последнему вопросу. В ряде работ было найде­но, что у людей [35-37] или экспериментальных животных [38, 39] эугликемическая гиперинсули- немия ассоциируется с ограничением почечной экскреции фосфата. При этом, не исключено, что гиперинсулинемия подавляет секрецию паратгормона, за счет чего и достигается антифосфатурический эффект [36]. Следует, однако, иметь в виду, что снижение экскреции фосфора у людей, несмотря на уменьшение секреции паратгормона, в условиях гиперинсулинемии наблюдалось не всеми исследователями [40].

Инсулин, по-видимому, также может стимули­ровать 1а,25(ОН)^Э₃ [41] - еще один фактор, спо­собствующий усилению тубулярной реабсорбции фосфата [28]. Сведений о возможных ассоциаци­ях между инсулином и FGF-23 в доступной лите­ратуре мы не обнаружили.

Не исключено, что инсулин способен и непо­средственно стимулировать тубулярный транс­порт как глюкозы [42], так и фосфата [43]. Воз­можно, эти эффекты сопрягаются через протеин- киназу Akt/PKB - один из ключевых ферментов в реализации действия инсулина на субцеллюляр- ном уровне [44]. Следует, правда, иметь в виду, что активация реабсорбции глюкозы через Akt2/ ΡΚΒβ показана для SGLT1 [42]. О таком эффекте в отношении SGLT2 неизвестно.

Так или иначе, имеющиеся данные свидетель­ствуют о возможной роли инсулина в сопряжении проксимальной реабсорбции глюкозы и фосфата. К сожалению, на основе этих сведений трудно объяснить антифосфатурический эффект эмпаф- лиглозина, поскольку, по крайней мере, в одной работе зафиксировано снижение кон­центрации инсулина под влиянием данного пре­парата у предиабетических крыс линии SHRcp [12].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенного исследования свиде­тельствуют о том, что назначение эмпаглифлозина в течение 1 мес недиабетическим крысам с экспе­риментальной сердечной недостаточностью при­водит к нарастанию глюкозурии, альбуминурии и экспрессии микроРНК-21 в моче. Выведение неорганического фосфора под влиянием данного препарата уменьшалось. Полученные данные по­зволяют полагать, что описанные в ряде исследо­ваний нефропротективные эффекты ингибиторов SGLT-2, скорее всего, являются непрямыми и, преимущественно, определяются способностью данных препаратов устранять гипергликемию и гломерулярную гиперфильтрацию при сахарном диабете. В то же время, нельзя исключить, что ингибиторы SGLT-2 могут оказывать определен­ное негативное непосредственное воздействие на состояние почек. Возможность таких эффектов, по-видимому, должна учитываться в клинической практике. Тем не менее, «почечные» последствия применения ингибиторов SGLT-2 и механизмы таких эффектов требуют дальнейшего изучения.