БЕЛОК KLOTHO, ФАКТОР РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ 23 И ПОЧЕЧНАЯ ЭКСКРЕЦИЯ КАЛЬЦИЯ НА НАЧАЛЬНЫХ СТАДИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ХРОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ ПОЧЕК

ВВЕДЕНИЕ

α-Klotho (Klotho) - трансмембранный белок типа 1 с молекулярной массой (м.м.) 130 кДа, со­держит крупный внеклеточный домен, состоящий из двух внутренних повторов (KL1 и KL2), имею­щих гомологию с β-глюкозидазой [1]. Внеклеточ­ный домен может подвергаться протеолитическому процессингу металлопротеазами ADAM10/17 (A Disintegrin And Metalloproteinase domain 10/17), попадать в циркуляцию и представляет собой вто­рую изоформу белка Klotho (116 кДа) [2]. Помимо этого, в результате альтернативного сплайсинга образуется третья секретируемая изоформа Klotho с м.м. 68 кДа, которая содержит только субъеди­ницу KL1 и не может быть заякорена на плазма­тической мембране [3]. Klotho экспрессирует­ся различными тканями и органами [1]. Однако считается, что почка является основным местом синтеза Klotho и источником его циркулирующих изоформ [4]. Функциональная роль различных изоформ Klotho все еще является предметом спо­ров. Циркулирующий Klotho предположительно обладает FGF23-независимыми гормональны­ми или ферментативными функциями, тогда как трансмембранная изоформа Klotho является корецептором гормона костного происхождения - фактора роста фибробластов 23 (FGF23). Предпо­лагают, что благодаря глюкозидазной активности циркулирующий Klotho способен модифициро­вать углеводный компонент катионных каналов TRPV5/ TRPV6, что приводит к их накоплению на плазматической мембране эпителиоцитов [5]. FGF23 действует на дистальные канальцы нефрона, где на базолатеральной мембране эпителиоцитов экспрессируются его канонический рецептор FGFR1c и ко-рецептор Klotho. Взаимодействие FGF23 с рецепторным комплексом приводит к запуску внутриклеточного сигнального каскада с участием ERK1/2, SGK1, WNK4 и увеличению количества TRPV5 на апикальной мембране [6]. По некоторым данным, при высокой концентра­ции FGF23 способен осуществлять свои биоло­гические функции через связывание с FGFR3 и FGFR4 даже в условиях дефицита белка Klotho [7]. С целью определения роли FGF23 и Klotho в регуляции канальцевой реабсорбции Са при ХБП была изучена взаимосвязь между уровнем ренальной экспрессии белка Klotho, сывороточной концентрацией FGF23 и экскрецией Са при экспери­ментальной дисфункции почек.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Экспериментальное моделирование. Исследо­вание выполнено на взрослых самцах крыс SHR массой тела 190-230 г (биоколлекция Института физиологии им. И.П. Павлова РАН). Общее коли­чество экспериментальных животных составило 54. Эксперимент проводили в соответствии с тре­бованиями по работе с лабораторными животны­ми, после согласования с комиссией по контролю содержания и использования лабораторных жи­вотных ПСПбГМУ им. И.П. Павлова. Животных содержали в стандартных условиях вивария, в клетках площадью 0,2 м² по пять крыс в каждой со свободным доступом к воде. Световой режим контролировался автоматически: 12 ч свет/12 ч темнота; температура в помещении составляла 20-22 ^oC. Животные получали стандартный ла­бораторный корм, содержащий 0,8 % Pi. Кормле­ние осуществляли ежедневно по 25-30 г корма на крысу. Для создания экспериментальной ренальной дисфункции применяли хирургические моде­ли резекции 3/4 или 5/6 почек [8, 9], контролем служили ложнооперированные животные с соот­ветствующим сроком эксперимента (табл. 1).

За сутки до выведения из эксперимента у жи­вотных измеряли артериальное давление (АД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) манжеточным методом, затем помещали в метаболические камеры и фиксировали для сбора мочи на 24 ч в условиях водной депривации. Взятие образцов крови и почечной ткани проводили при выведе­нии животных из эксперимента.

Биохимическое исследование Кровь и мочу центрифугировали при 1500 g в течение 10 мин, после чего проводили исследования. Часть био­материала хранили при температуре -80 ^оС. Срок хранения составил не более 6 мес при постоян­ном контроле температурного режима. Концен­трацию Ca, креатинина (Cr) определяли на авто­матическом анализаторе SYNCHRON CX DELTA (Beckman Сoulter, США).

Абсолютную экскрецию Ca (UCa₂₄) рассчиты­вали по формуле:

UCa₂₄ (ммоль) = uCa х D, где uCa - концентрация Ca в моче (ммоль/л), D - диурез за 24 ч (л).

Фракционную экскрецию Ca (FECa) рассчиты­вали по формуле:

FECa (%) = (uCa х sCr)/(sCa х uCr) х 100, где uCa - концентрация Ca в моче (ммоль/л), sCa - концентрация Ca в сыворотке (ммоль/л), uCr - концентрация креатинина в моче (ммоль/л), sCr - концентрация креатинина в сыворотке (ммоль/л).

Скорость клубочковой фильтрации у крыс оце­нивали по клиренсу креатинина, рассчитанному по формуле:

CCr (мл/мин) = (uCr х D)/(sCr х 1440), где uCr - концентрация креатинина в моче (ммоль/л), sCr - концентрация креатинина в сыво­ротке (ммоль/л), D - диурез (мл), 1440 - количе­ство минут в сутках.

Концентрации интактных PTH и FGF23 в сы­воротке крови крыс определяли иммуноферментным методом с использованием тест-систем «Rat Intact PTH ELISA Kit» (Immutopics, Inc., США) и «FGF23 ELISA Kit» (Kainos Laboratories, Inc., Япония).

Гистологическое исследование. Почку фикси­ровали в 5 % нейтральном формалине (рН 7,2) при комнатной температуре (22 °С) в течение 16 ч, готовили срезы толщиной не более 4 мкм. Пло­щадь коллагенового фиброза измеряли в 10 по­лях зрения для каждого микропрепарата почки, окрашенного по методике трихром по Массону.

Для детекции Klotho в паренхиме почки исполь­зовали первичные поликлональные антитела кро­лика ab69208 (Abcam, Великобритания), систему Dako EnVision (Dako, США) и подкрашивали ге­матоксилином. Содержание Klotho исследовали в корковом веществе почки на участках тубулоин- терстиция без существенных фибропластических изменений в 10 полях зрения для каждого гисто­логического препарата при помощи программы «Видео ТесТ-Морфология 5.2» (ООО «Видео­тест», Россия).

Доля S² продукта (%) = [(Σ¹⁰ А/Б)/10] х100,

где А - площадь масок со специфическим про­дуктом реакции; Б - площадь поля зрения.

Статистический анализ проводили при помо­щи пакета SAS/STAT 6.1. Данные представлены как среднее и стандартное отклонение (M±SD) или медиана с интерквартильным размахом (m [25 %-75 %)]. Для сравнения групп в зависимости от типа переменной и характера распределения применяли следующие тесты: F-критерий Фише­ра, критерий Краскелла-Уоллиса. Для исследова­ния связей между переменными применяли кор­реляционный анализ Спирмена и множественный регрессионный анализ. Межгрупповые различия и регрессионные коэффициенты считали стати­стически значимыми при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Соответствие моделей начальным стадиям хро­нической болезни почек (ХБП) подтверждалось за­кономерными изменениями показателей функции почек и выраженностью ренального фиброза у экс­периментальных животных (рис. 1).

При снижении функции почек у спонтанно гипертензивных крыс наблюдали рост экскретируемой фракции и абсолютной экскреции Ca (рис. 2, Б), сопровождающийся снижением ренальной экспрессии белка Klotho (см. рис. 2, Г) при от­сутствии достоверных изменений концентраций PTH и FGF23 (см. рис. 2, В, Д). Концентрация Ca в сыворотке крови значимо не изменялась (см. рис. 2, А).

Ренальная экскреция кальция имела досто­верные корреляционные связи с концентрациями PTH, FGF23, экспрессией Klotho в почке и в сыво­ротке крови (табл. 2).

При регрессионном моделировании FECa и UCa₂₄ были независимо связаны с sCr, но не с экс­прессией белка Klotho в почке, концентрациями FGF23 и PTH. Ассоциаций sCa с исследуемыми показателями выявлено не было (табл. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

До недавнего времени PTH считался главным гормоном, противодействующим гипокальциемии, закономерно развивающейся при ХБП. В экспериментальных исследованиях последних лет было показано, что FGF23 и его ко-рецептор Klotho также способны регулировать реабсорб­цию Ca в тубулярном эпителии [5, 10]. При этом активация регуляторной системы FGF23/Klotho/ FGFRs предположительно происходит несколько раньше реакции паращитовидных желез и роста концентрации PTH [11].

В настоящем исследовании при снижении функции почек у спонтанно гипертензивных крыс наблюдали рост относительной и абсолют­ной экскреции кальция при тенденции к увеличе­нию концентраций PTH и FGF23 в крови, а также закономерном снижении ренальной экспрессии белка Klotho. Однако выявленные корреляцион­ные зависимости противоречат предполагаемым молекулярным механизмам действия исследуе­мых гормонов [5, 6, 10]. Уровень FGF23 прямо коррелировал с FECa. Эффекты FGF23, напро­тив, способствуют увеличению реабсорбции Ca, а рост его концентрации должен был бы приво­дить к снижению экскреции Са почками. Наблю­даемая корреляционная зависимость может быть связана с FGF23-опосредованным нарушением образования кальцитриола [12, 13]. Известно, что действие FGF23 связано с угнетением синтеза активной формы D-гормона [12]. В свою очередь кальцитриол участвует в регуляции реабсорб­ции Са не только через действие на экспрессию и секрецию PTH, но также стимулирует внутри­клеточный транспорт через цитоплазматиче­ский D-зависимый кальций-связывающий белок (кальбиндин-D) и АТФ-зависимую Са-помпу на базолатеральной мембране [13].

Физиологически обоснованной могла бы яв­ляться обратная корреляционная зависимость меж­ду мочевой экскрецией кальция и Klotho. Как пред­полагают, последний может обладать разнообраз­ными FGF23-независимыми свойствами, включая регуляцию Са-каналов (TRPC5/TRPC6) [14-20].

Полученные нами данные регрессионного мо­делирования не подтверждают предположений о том, что Klotho и FGF23 независимо связаны с регуляцией почечной экскреции Са, как и данные других исследований [21]. Существенно более высокие показатели UCa₂₄ и FECa при увеличении степени выраженности экспериментальной дис­функции почек, очевидно, обусловлены действи­ем иных Са-регулирующих механизмов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экскреция Са почками в условиях ранних ста­дий экспериментальной ХБП, по-видимому, не за­висит от эффектов Klotho и FGF23.

Работа выполнена при поддержке Российского Фонда фундаментальных исследований (гранты №13­04-01886, №18-015-00425, №18-315-00342).