Взаимосвязь показателей аутофагии, апоптоза и внутриклеточной деградации белка с композиционным составом тела у пациентов с хронической болезнью почек, находящихся на программном гемодиализе: результаты когортного исследования

ВВЕДЕНИЕ

Распространенность хронической болезни по­чек (ХБП) среди взрослого населения Российской Федерации сопоставима с распространенностью артериальной гипертензии и составляет около 10 %. Высокая социальная значимость указан­ной нефрологической патологии обусловлена все большей вовлеченностью лиц молодого, а соот­ветственно, трудоспособного возраста [1]. Высо­кой остаётся и смертность от ХБП в мире, дости­гающая 1 200 000 человек ежегодно [2].

Молекулярные механизмы повреждения игра­ют существенную роль в развитии нефрологической патологии. Установлен значимый вклад в развитие патологического процесса аутофагии и апоптоза [3]. Развитие нефрологической патоло­гии сопровождается пролиферацией клеток, на­коплением внеклеточного матрикса и развитием нефросклероза. Нарушение почечной функции определяется как степенью нефросклероза, так и гибелью канальцевого эпителия. Последнее про­исходит преимущественно путем апоптоза [4]. Заболевания, приводящие к ХБП, - гломерулосклероз, кортикальный некроз, обструктивные нефропатии, рефлюкс-нефропатии, гидронефроз, поликистоз, интерстициальный нефрит также со­провождаются активацией апоптоза [5].

Маркером активности внутриклеточной дегра­дации белка является уровень 20S-протеасомы. Изучена ее роль у пациентов с дисфункцией почек и синдромом белково-энергетической недостаточ­ности [6]. При этом взаимосвязь активности по­казателей аутофагии, апоптоза и внутриклеточной деградации белка у пациентов с ХБП С5д стадии и композиционного состава тела остается невыяс­ненной. Также невыясненной остается взаимос­вязь активности указанных показателей и эффек­тивности диализа.

Цель: изучить взаимосвязь активности аутофагии, апоптоза и внутриклеточной деградации бел­ка с композиционным составом тела у пациентов с ХБП С5д стадии.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Выполнено когортное проспективное исследо­вание, в которое включили 106 пациентов с ХБП С5д стадии. Процедуры гемодиализа (ГД) осу­ществляли три раза в неделю по 4 ч на аппара­тах «5008 CorDiax» («Fresenius Care», Германия) с использованием бикарбонатной буферной диа­лизной жидкости и полисульфоновых высокопо­точных диализных мембран «FX 50», «FX 60», «FX 80» или «FX 100» с площадью поверхности от 1,5 до 2,3 м². Средний возраст пациентов соста­вил 50,9 ± 12,3 года. Средняя продолжительность диализного лечения - 32,8 (17,5-48,5) мес. Доля пациентов мужского пола составила 58,5 % (62 из 106).

Критерии включения: пациенты с ХБП С5д. Критерии невключения: хронический перитоне­альный диализ; возраст менее 18 и старше 80 лет; патология мышечной ткани; наркомания и алкого­лизм; психические заболевания, подтвержденные документально; отказ от участия в исследовании.

Базами для исследования явились: кафедра вну­тренних болезней с основами физиотерапии №2 ФГБОУ ВО РостГМУ Минздрава России; диализ­ный центр «ООО Фрезениус Медикал Кеа Кубань» (г. Ростов-на-Дону, Россия), лаборатория медицин­ского центра ООО «Новомедицина» (г. Ростов-на- Дону, Россия). Базами для исследования явились: кафедра внутренних болезней с основами физио­терапии №2 ФГБОУ ВО РостГМУ Минздрава Рос­сии; диализный центр «ООО Фрезениус Медикал Кеа Кубань» (г. Ростов-на-Дону, Россия), лаборато­рия медицинского центра ООО «Новомедицина» (г. Ростов-на-Дону, Россия). Продолжительность исследования: 01.08.2016 - 01.12.2017.

Проводились детальный сбор клинико­анамнестических данных, физикальное и лабо­раторное обследование, включавшее сбор жалоб, анамнеза, проведение объективного осмотра, лабораторное обследование - анализ активно­сти внутриклеточной деградации белка (актив­ность 208-протеасомы), аутофагии (активность Beclin-1) и апоптоза (активность Bcl-2).

Основной исход исследования: классификация активности аутофагии и апоптоза и композицион­ного состава тела у пациентов с высоким и низ­ким уровнем активности.

Дополнительные исходы исследования: эф­фективность диализного лечения при различной активности аутофагии и апоптоза.

Показателями, характеризующими актив­ность аутофагии, апоптоза и внутриклеточной деградации белка, являлись Beclin-1, Bcl-2 и 20Б-протеасома. Группа I - низкая активность, группа II - высокая активность.

Определение активности показателей осущест­влялось методом количественного иммунофер- ментного анализа на иммуноферментном анализа­торе «BRIO-ELISA» («RADIM», США): Beclin-1 - при помощи набора «ELISA Kit for Beclin 1» («Cloud-Clone Corp.», США), 20S-протеасомы - набора «ELISA Kit for 20S-Proteasome» («Cloud- Clone Corp.», США), Bcl-2 - набора «ELISA Kit for B-Cell Leukemia/ Lymphoma 2» («Cloud-Clone Corp.», США).

Биоимпедансный анализ выполнен при по­мощи биоимпедансного анализатора «Body Composition Monitor» (ВСМ) - монитор соста­ва тела с программным обеспечением «Fluid Management Tool» (FMT) фирмы «Fresenius» (Гер­мания, регистрационное удостоверение № ФСЗ 2009/03662, от 05.02.2009 г.). Определялись пока­затели: сухая масса, масса до диализа, индекс мас­сы тела, жировой массы (абсолютный показатель и доля), безжировой массы, активной клеточной массы (абсолютный показатель и доля), общего объема жидкости, объема внутриклеточной и вну­триклеточной жидкости, основного обмена, мета­болического возраста.

Оценка эффективности гемодиализа прово­дилась путем вычисления показателя Kt/V, в ко­тором K - клиренс диализатора по мочевине, мл/ мин, t - время диализа, ч, V - объем распределе­ния мочевины в организме, мл [7]. Гемодиализ с Kt/V менее 1,2 за одну процедуру и соответствен­но менее 3,6 в неделю считался неадекватным [8].

Протокол исследования одобрен локальным независимым этическим комитетом ФГБОУ ВО РостГМУ Минздрава России (протокол №13/18 от 13.09.2018 г.).

Для статистического анализа использова­ли пакеты прикладных программ «Excel-2016» («Microsoft Corp.», США) и «Statistica-12» («StatSoft», США). Размер выборки предвари­тельно не рассчитывали. Характер распределения (нормальное или отличное от нормального) оце­нивали при помощи одновременного вычисления для каждого показателя критериев Колмогорова-Смирнова, Шапиро-Уилка и Лиллиефорса. Рас­пределение считали отличным от нормального, если два критерия и более отвергали нулевую гипотезу. Представление количественных пока­зателей при их нормальном распределении вы­полнено в виде M ± SD, при распределении, от­личном от нормального, - Me (25-75 центиль). Выявление статистической значимости различий количественных переменных выполняли для двух выборок путем вычисления t-критерия Стьюдента при нормальном распределении или непараметри­ческого критерия Манна-Уитни для показателей, распределение которых отличалось от нормально­го. Выявление статистической значимости разли­чий для качественных/ порядковых переменных выполнено при помощи критерия хи-квадрат для таблиц сопряженности вида 2 х 2 или точного F-критерия Фишера, если количество наблюдений в одной из ячеек четырехпольной таблицы было менее 5. Кластерный анализ выполнен для коли­чественных данных. Близость между объектами определена путем вычисления евклидова расстоя­ния. Для классификации объектов использован итеративный метод k-средних. После классифика­ции оценка статистической значимости различия между кластерами осуществлялась путем прове­дения дисперсионного анализа. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ структуры сопутствующей патологии у пациентов с ХБП С5д стадии выявил преобла­дание сердечно-сосудистой патологии - 95,3 % (101 из 106), среди которой ведущей являлась ги­пертоническая болезнь - 89,6 % (95). В структуре нефрологической патологии 42,5 % (45 человек), кроме ХБП С5д стадии, преобладал хронический гломерулонефрит - 33,0 % (35 человек). Ведущим среди эндокринной патологии (20,8 %; 22 челове­ка) являлся сахарный диабет - 13,2 % (14 чело­век).

У большинства больных отмечено сочетание двух нозологий и более - 68,9 % (73 человека), одна нозология имела место у 34,9 % (37 человек). У 3,8 % (4 человека) точное количество коморбид- ных заболеваний не установлено.

Активность аутофагии, апоптоза и внутрикле­точной деградации белка определена 80 больным указанной группы (75,5 %).

Выполнена классификации показателей Beclin-1, 20S-протеасомы и Bcl-2. Диапазон кла­стера «высокая активность» Beclin-1 составил 2,4 ± 0,4 нг/мл, «низкая активность» - 1,4 ± 0,2 нг/ мл; аналогичных кластеров 20S-протеасомы - 62,0 ± 7,1 и 31,9 ± 6,7 нг/мл; кластеров Bcl-2 - 4,2 ± 0,6 и 1,8 ± 0,5 нг/мл соответственно. Разли­чия между кластерами были статистически значи­мыми.

Установлено (табл. 1), что больные с низкой активностью Beclin-1 характеризовались более низким показателем безжировой массы. Пациен­ты с низкой активностью 20S-протеасомы и Bcl- 2 имели более высокие показатели безжировой массы. Абсолютный показатель активной кле­точной массы был выше при высокой активности Beclin-1 и низкой - 20S-протеасомы и Bcl-2. Од­нако межгрупповые различия характеризовались только тенденцией к достоверности.

Больным с низкой активностью Beclin-1 соот­ветствовал более низкий показатель общей воды. У пациентов с низкой активностью 20S-протеасомы и Bcl-2 имел место более высокий уровень общей воды. Аналогичная направленность показателей была характерна и для общего объема жидкости. В группе с низкой активностью Beclin-1 показатель общего объема жидкости был ниже по сравнению с высокой активностью Beclin-1. В группе с низ­кой активностью 20S-протеасомы показатель об­щего объема жидкости был выше по сравнению с группой с высокой активностью 20S-протеасомы. Также в группе с низкой активностью Bcl-2 об­щий объем жидкости был выше по сравнению с группой с высокой активностью Bcl-2.

Увеличение жидкости в организме больных с ХБП С5д стадии происходило преимущественно равномерно как за счет внутриклеточной, так и за счет внеклеточной воды. Об этом свидетельству­ет отсутствие межгрупповых различий у пациен­тов с высокой и низкой активностью изучаемых показателей. Исключение составили пациенты с разной активностью Beclin-1, у которых при низ­кой активности показателя объем внеклеточной жидкости был ниже по сравнению с высокой ак­тивностью Beclin-1; у пациентов с низкой актив­ностью Bcl-2 объем внутриклеточной жидкости был выше, чем у больных с высокой активностью Bcl-2.

Нами не было выявлено межгрупповых разли­чий показателей сухой массы, массы до диализа, массы тела в процентах от идеальной, индекса массы тела, жировой массы (абсолютный и отно­сительный показатели), активной клеточной мас­сы (абсолютный и относительный показатели), основного обмена и метаболического возраста.

В ходе настоящего исследования установлено (табл. 2), что у больных с низкой активностью Bcl-2 отмечался объем внутриклеточной жид­кости выше референсного показателя; в группе с высоким уровнем Bcl-2 ни у одного больного не было показателя внутриклеточной жидкости выше верхней границы референсного интервала.

Не обнаружено статистически значимых межгрупповых различий частот референсных, сни­женных и повышенных показателей сухого веса, индекса массы тела, жировой массы (абсолютный и относительный показатели), безжировой массы (абсолютный и относительный показатели), ак­тивной клеточной массы (абсолютный и относи­тельный показатели), объема внеклеточной жид­кости и основного обмена.

Изучение эффективности диализного лечения выявило, что больным с низким уровнем Beclin-1 требовалась более низкая доза диализа в отличие от пациентов с более высоким уровнем Beclin-1. Пациентам же с низким уровнем 208-протеасомы и Bcl-2 доза диализа требовалась больше (табл. 3).

Не выявлено статистически значимых межгрупповых различий показателей длительности диализного лечения, Kt/V и коэффициента сниже­ния мочевины.

Не выявлено статистически значимых раз­личий качества гемодиализа (неадекватное, адекватное, оптимальное, идеальное) у паци­ентов с низким и высоким уровнями Beclin-1, 208-протеасомы и Bcl-2. Однако установлено, что качество диализа у большинства больных харак­теризовалось как адекватное или оптимальное. Доля адекватного диализа в группе наблюдения с низкой активностью Beclin-1 составила 49,3 % (33), 208-протеасомы - 50,0 % (7) и Bcl-2 - 50,0 % (9), в группе с высокой активностью Beclin-1 - 53,8 % (7), 208-протеасомы - 50,0 % (33) и Bcl-2 - 50,0 % (31). Доля оптимального диализа была у больных с низкой активностью Beclin-1 47,8 % (32), 208-протеасомы - 35,7 % (5), Bcl-2 - 38,9 % (7); с высокой активностью Beclin-1 - 30,8 % (4), 20S-протеасомы - 47,0 % (31) и Bcl-2 - 46,8 % (29). Нежелательных явлений выявлено не было.

ОБСУЖДЕНИЕ

Установлена низкая активность Beclin-1 у больных с низкой безжировой массой, низким показателем общей воды и низким объемом вне­клеточной жидкости. В то же время, высокая активность Beclin-1 была характерна для паци­ентов с высокой активной клеточной массой. Вы­явлена однонаправленность показателей Bcl-2 и 20S-протеасомы, характеризующаяся сниженной активностью указанных показателей у больных при увеличении безжировой массы, активной кле­точной массы, общей воды и внутриклеточной жидкости.

Аутофагия - процесс утилизации клеточных органелл и макромолекул, который в условиях не­достатка питательного субстрата может приводить к клеточной гибели путем утилизации неизменен­ных клеточных органелл [9]. Апоптоз - энергоза­висимая трансформация клеток, являющаяся как способом уничтожения (программируемая кле­точная гибель), так и средством выживания в за­висимости от условий среды [10].

Высокая активность Beclin-1 является марке­ром активации апоптоза. Указанный белок входит в состав инициаторного комплекса аутофагии и сборки аутофагосомной мембраны de novо. Дан­ный процесс является энергозависимым и, соот­ветственно, чувствительным к уровню АТФ [11].

Антиапоптотический белок Bcl-2 является трансмембранным белком митоходрий и цито­плазматического ретикулума [10] и подавляет аутофагию путем связывания белка Beclin-1, что позволяет клеткам избежать программируемой гибели вследствие аутофагии [12].

Полученные нами данные свидетельствуют, что, в целом, пациенты с ХБП 5 стадии харак­теризовались сниженным уровнем активности всех изучаемых компонентов (Beclin-1, Bcl-2, 20S-протеасома). Исключение составил лишь вы­сокий уровень активности Beclin-1, сочетающий­ся с высоким уровнем активной клеточной массы. Процессы аутофагии, апоптоза и внутриклеточ­ной деградации белка являются энергозависимы­ми [11]. Соответственно снижение их активности является косвенным признаком внутриклеточной энергетической недостаточности у больных с ХБП 5 стадии.

Высокий уровень безжировой массы характе­ризует высокий уровень развития мышечной тка­ни, поскольку прирост показателя обеспечивается преимущественно увеличением мышечной, а не костной массы, количество которой является от­носительно постоянным. Полученные нами дан­ные свидетельствуют о том, что в условиях низ­кой активности апоптоза происходит снижение мышечной массы, при этом снижение аутофагии и внутриклеточной деградации белка приводит к увеличению мышечной массы. Можно предполо­жить, что в условиях снижения энергоснабжения клетки происходит торможение апоптоза и вну­триклеточной деградации белка, что сопровожда­ется увеличением мышечной массы.

Активная клеточная масса является суммой костной, мышечной массы и массы внутренних органов. Соответственно активация апоптоза яв­ляется средством наращивания активной клеточ­ной массы на фоне снижения активности аутофагии и внутриклеточной деградации белка.

Снижение активности апоптоза сочетается со снижением общей воды в организме и объема вне­клеточной жидкости, что требует меньших усилий для ее выведения и повышает эффективность диа­лиза. Однако снижение активности аутофагии и внутриклеточной деградации белка, наоборот, ха­рактеризуется волемией, сопряженной с увеличе­нием как общей, так и внутриклеточной жидкости.

В целом, полученные данные свидетельствуют о преимущественно взаимоисключающих эффек­тах аутофагии и апоптоза на композиционный со­став тела больных с ХБП 5 стадии. Ограничения исследования не выявлены.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Больные с ХБП С5д стадии характеризуют­ся снижением активности аутофагии, апоптоза и внутриклеточной деградации белка, что может быть следствием внутриклеточной энергетиче­ской недостаточности. В то же время выявлено взаимоисключающее влияние механизмов аутофагии и апоптоза на композиционный состав тела у пациентов с ХБП 5 стадии: активирующее влия­ние одного процесса сопровождается тормозным влиянием со стороны противоположного.