Изменение реактивности сосудов крыс с экспериментальным уменьшением массы функционирующих нефронов

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время известно, что сердечно­сосудистая система и почки являются настолько функционально связанными, что принято гово­рить о существовании кардиоренального кон­тинуума [1], частными проявлениями которого могут считаться кардиоренальные синдромы [2]. У пациентов с патологией почек (хроническая болезнь почек - ХБП) отмечается повышенный риск кардиоваскулярной заболеваемости и смерт­ности [1, 3, 4, 5]. При этом ХБП рассматривается в качестве независимого фактора риска сердечно­сосудистых осложнений даже при умеренном снижении массы действующих нефронов (ран­ние стадии ХБП) [4, 5]. Среди больных ХБП риск сердечно-сосудистой смертности в 10-100 раз больше, чем у здоровых лиц [3].

При этом коронарная патология (коронарная болезнь сердца - КБС) является одной из основ­ных причин смерти у пациентов с ХБП, а выжи­ваемость больных с хронической почечной дис­функцией, подвергшихся коронарной реваскуляризации, хуже, чем при отсутствии повреждений почек. Частота и тяжесть обструктивных вариан­тов КБС нарастают по мере снижения скорости клубочковой фильтрации (СКФ). КБС при ХБП характеризуется диффузным вовлечением многих сосудов и их кальцификацией [6, 7].

Показано, что при ХБП риск смерти от сердечно­сосудистых осложнений увеличивается вследствие ускоренного развития атеросклероза, повышен­ной жесткости артерий и дисфункции эндотелия. Padberg и соавт. также выявили, что ХБП связана с повреждением эндотелиального гликокаликса (ЭГ), которое выражается в уменьшении толщины ЭГ и повышением в крови содержания продуктов распада ЭГ [8]. В свою очередь артериальная ги­пертензия (АГ) и гипертрофия левого желудочка у пациентов с ХБП считаются важными факторами кардиоваскулярного риска [9, 10]. Однако традици­онные факторы сердечно-сосудистого риска, такие как АГ, гиперлипидемия и сахарный диабет, не пол­ностью объясняют высокие кардиоваскулярную за­болеваемость и смертность в условиях уменьше­ния количества функционирующих нефронов [11, 12]. Несмотря на то, что существует четкая обрат­но пропорциональная зависимость между сниже­нием скорости клубочковой фильтрации (СКФ) и сердечно-сосудистой заболеваемостью, механиз­мы, которые приводят к росту летальных случаев от сердечно-сосудистых осложнений при дисфунк­ции почек, остаются недостаточно изученными [12]. До сих пор нет единого мнения и о механизмах регуляции сосудистого тонуса при ХБП. Ответы на эти вопросы необходимы как для выработки адек­ватных методов коррекции сердечно-сосудистых осложнений при нарушении функции почек, так и для подбора превентивных мер, позволяющих предупредить или снизить негативное влияние по­чечной патологии на миокард и сосуды.

Более ясную картину может дать использо­вание различных экспериментальных моделей, в том числе основанных на уменьшении массы функционирующей паренхимы почек. Однако большинство исследований состояния сердца и сосудов на таких моделях выполнено через срав­нительно короткие сроки после индукции почеч­ной недостаточности (2 мес. или менее). В связи этим мы сочли целесообразным оценить измене­ния эндотелийзависимой регуляции тонуса крове­носных сосудов (аорты и верхней брыжеечной ар­терии) у крыс через 4 мес после удаления 5/6 по­чечной ткани (5/6 НЭ), учитывая, что данный срок продолжительности жизни крысы эквивалентен 10-12 годам продолжительности жизни человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проведены на 22 крысах, сам­цах стока Wistar (масса 200-250 г) из биоколлек­ции лабораторных животных Института физио­логии им. И.П. Павлова РАН. Исследование было одобрено этическим комитетом Института физио­логии им. И.П. Павлова РАН. Животные содержа­лись в условиях вивария, получали стандартный пищевой рацион и питьевую воду ad libitum.

Крысы были разделены на две группы. В пер­вую группу вошли животные (n=12), подвергну­тые резекции 5/6 массы ткани почек (НЭ). Вторую (контрольную) группу составили ложноопериро- ванные (ЛО) крысы (n=10).

Экспериментальную модель ХБП создавали за счет резекции 5/6 массы почечной ткани. Опера­цию проводили под наркозом в два этапа с интер­валом в одну неделю. В качестве наркоза (внутри­мышечное введение) использовали ксилазин (0,05 мл) в сочетании с тилетамин/золазепамом (0,3 мл). На первом этапе удаляли 2/3 массы левой почки. На втором - полностью удаляли контрлатеральную правую почку. Для доступа к почкам использова­ли заднепоясничный разрез. С целью сохранения надпочечников почки перед резекцией декапсули- ровали. Контрольным животным «ложную» опера­цию также выполняли в два этапа с интервалом в одну неделю: операционную рану почки извлекали на 4-5 минут и без нефрэктомии помещали обрат­но. Такая модель до настоящего времени является «золотым стандартом» для изучения самых разных аспектов хронической болезни почек (ХБП) [13­17]. После поэтапной резекции почечной ткани дальнейшее длительное существование организма в условиях резкого сокращения массы действую­щих нефронов сопровождается развитием гемодинамических, метаболических и иммунных сдвигов (системная и гломерулярная гипертензия, наруше­ния липидного обмена или кальций-фосфорного гомеостаза, хроническое воспаление и т.д.), почти идентичных появляющимся при прогрессировании ХБП у человека. В силу всего изложенного выше мы сочли модель 5/6 НЭ полностью соответствую­щей целям нашего исследования.

Срок наблюдения после оперативного вме­шательства составлял 16 недель. По истечению этого срока у бодрствующих крыс проводили из­мерение систолического артериального давления (АД) манжеточным методом на хвосте, исполь­зуя электроманометр фирмы ELEMA (Швеция), а также определяли частоту сердечных сокращений (ЧСС) за 1 минуту. Для каждой крысы выполняли 4-5 замеров АД и рассчитывали среднее значение трех последних измерений.

Эвтаназию животных осуществляли посред­ством декапитации, во время которой отбирались образцы крови для последующего анализа. В сыворотке крови определяли уровень мочевины (ммоль/л) на автоанализаторе «Cobas E Mira».

После декапитации у крыс иссекали грудную аорту и верхнюю брыжеечную артерию (ВБА) и помещали в охлажденный до +2 - +4 ^оС физио­логический раствор, в котором они хранились до момента исследования. Исследования проводили на сегментах сосудов длиной 2 мм, которые выре­зали из аорты и ВБА, предварительно очищенных от жира и соединительной ткани.

Всего было подготовлено 23 сегмента аорты и 17 сегментов ВБА от крыс с нефрэктомией и 18 сег­ментов аорты и 15 сегментов ВБА от контрольных животных. Подготовленные сосудистые препараты помещали в термостатируемую (+37,0±0,1^оС) ка­меру миографа с проточным физиологическим со­левым раствором следующего состава (ммоль/л): NaCl - 120,4; KCl - 5,9; CaCl₂ - 2,5; MgCl₂ - 1,2; NaH₂PO₄ - 1,2; NaHCO₃ - 15,5; глюкоза - 11,5. Физиологический раствор сатурировали газовой смесью, состоящей из 95 % О₂ и 5 % СО₂. Для из­мерения силы сокращений препаратов использо­вали датчик FORT-10 (WPI, USA). Препараты под­вергали исходному натяжению, соответствующему трансмуральному давлению 90 мм рт. ст. и после 30-минутной стабилизации регистрировали пара­метры их сократительной активности. Подробно методика эксперимента описана ранее [18].

В исследовании использовали: ацетилхолин (Acetylcholine chloride, Sigma-Aldrich) 1×10^–10 – 1×10^-4 М; L-NAME (N_ω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride, ICN Biomedicals) 1×10^–4 М; тетраэтиламмоний (Tetraethylammonium chloride, Sigma-Aldrich), 1×10^–3 М; фенилэфрин (Phenylephrine, Sigma-Aldrich), 1×10^–6 М.

После выведения из эксперимента у крыс так­же выделяли и взвешивали сердце. По результа­там измерений рассчитывали индекс массы мио­карда левого желудочка (ИММЛЖ), равный отно­шению: масса миокарда левого желудочка/ масса животного (мг/г).

Статистическую обработку полученных ре­зультатов проводили с помощью программы «StatSoft STATISTICA 6.1.478». Поскольку полу­ченные данные имели нормальное распределе­ние, они представлены в виде средних значений со стандартной ошибкой средней (M±SE). Для установления достоверности различий исполь­зовали t-критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Исследования проведены в соответствии с Наци­ональным стандартом Российской федерации ГОСТ 3-53434-2009 «Принципы надлежащей лаборатор­ной практики», Приказом Министерства здравоох­ранения и социального развития РФ от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабора­торной практики» при одобрении Этическим коми­тетом Института физиологии им. Павлова РАН.

РЕЗУЛЬТАТЫ

НЭ у крыс приводила к прогрессивному на­растанию азотемии. Так, через 4 месяца после резекции почечной ткани содержание мочевины в сыворотке крови у крыс увеличивалось в среднем до 20,1±2,6 ммоль/л по сравнению с контрольны­ми животными (4,9±0,6 ммоль/л, р <0,001). Умень­шение массы функционирующих нефронов у крыс сопровождалась развитием гипертензии: прирост систолического АД составлял в среднем 30 % от исходного уровня, достигая 165, 0±9,8 мм рт. ст. (по сравнению с 127,2±9,7 мм рт. ст. в группе ЛО животных, р <0,01). Однако при этом значимые различия частоты сердечных сокращений у крыс с НЭ (415±33 уд/мин) и животных ЛО группы (380±19 уд/мин, р>0,05) отсутствовали. В то же время ИММЛЖ у крыс через 4 месяца после НЭ был значительно выше, чем в ЛО группе (в сред­нем 2,72±0,11 мг/г и 2,35±0,09 мг/г соответствен­но, р<0.001). Таким образом, НЭ приводила к нару­шениям функционирования сердечно-сосудистой системы, выраженным в развитии вторичной ре- нальной артериальной гипертензии и активизации процессов ремоделирования миокарда.

Для оценки реактивности сосудов измерение исходного тонуса сосудистых сегментов начинали с 30-й минуты эксперимента, когда наступала его стабилизация после размещения фрагмента сосу­да в камере установки. Сегменты аорты и верхней брыжеечной артерии НЭ животных в стандарт­ных условиях демонстрировали более высокий уровень тонического напряжения по сравнению с препаратами, полученными от контрольных крыс. В наших исследованиях исходный тонус интакт- ных (с сохраненным эндотелиальным слоем) сегментов аорт в ЛО группе составил 262±24 мг, ВБА - 233±20 мг. Уменьшение количества функ­ционирующих нефронов на данных сроках на­блюдения приводило к увеличению исходного то­нуса как аорты, так и ВБА (рис.1).

Для изучения механизмов регуляции тонуса со­судов у животных, подвергнутых резекции почеч­ной ткани, использовали оценку степени вазодила- тации исследуемых фрагментов сосудов при введе­нии в омывающий раствор ацетилхолина (АХ). В предыдущих работах было показано, что реакция аорты и брыжеечной артерии на АХ при исходном тонусе имеет небольшую амплитуду (18). Поэтому исследования принято проводить в условиях пред­варительной констрикции сосудов, воздействуя на них до начала тестирования фенилэфрином. До­бавление в физиологический раствор фенилэфрина в концентрации 1x10^-6 М приводило к сокращению ГМК сосудов, о котором судили по повышению уровня тонического напряжения сосудистого фраг­мента. Последующую оценку вазодилататорного действия АХ проводили только после стабилиза­ции тонуса фрагментов сосудов на новом уровне.

Введение в раствор АХ в концентрации 1x10^-6 М приводило к выраженной вазодилатации фраг­мента аорты крыс обеих групп (рис. 2). Однако вызванная АХ дилатация аорты крыс, подвер­гнутых НЭ, оказалась меньшей, чем у контроль­ных ЛО животных. Таким образом, уменьшение массы функционирующих нефронов приводило к значимому снижению ответной реакции сегмента аорты на воздействие АХ.

Аналогичная закономерность наблюдалась и в исследовании действия АХ на верхнюю брыжееч­ную артерию (рис. 2). Следует отметить, что реак­ция на АХ сегментов ВБА, выраженная в процен­тах от амплитуды их сокращения на фенилэфрин, была большей, чем ответ аорты, как у крыс с НЭ, так и у ЛО животных.

Для уточнения механизмов влияния НЭ на эндотелийзависимую регуляцию тонуса сосудов, в частности, определения роли NO, в физиологиче­ский раствор сначала вводили ингибитор синтазы NO - L-NAME, а затем фенилэфрин и АХ. В таких условиях АХ также оказывал вазодилататорное действие на аорту и ВБА, однако выраженность дилатации была меньше, чем в исследовании с со­хранением синтеза NO (рис. 3). Следует отметить, что в исследованиях этой серии снижение вызван­ной АХ вазодилатации как аорты, так и ВБА у крыс с НЭ было менее выражено, чем у контроль­ных ЛО животных. В то же время снижение ответа сосудов животных, подвергнутых резекции части почечной паренхимы на введение АХ в раствор, было большим у фрагментов аорты (в 1,9 раза по сравнению с ЛО группой), чем у ВБА (1,4 раза). Таким образом, уменьшение ответа сосудистых фрагментов крыс с НЭ на АХ при ингибировании синтеза NO по сравнению с ЛО группой указывает на нарушение продукции NO эндотелием сосудов животных данной экспериментальной группы.

Для уточнения роли эндотелиальной гиперпо­ляризации в реакции сосудов на АХ при развитии уремии использовали блокаду Са²+-активируемых К+-каналов большой проводимости введением в раствор ТЭА (1×10^–6 М). В этих условиях АХ вы­зывал вазодилатацию предварительно сокращен­ных фенилэфрином сосудов (рис. 4) как в группе животных после НЭ, так и у контрольных крыс. Однако величина ответа была различной. У крыс, подвергнутых уменьшению количества функцио­нирующих нефронов, регистрировалось значимое снижение вазодилататорного ответа сосудов (по сравнению с ЛО животными), более выраженное у фрагментов ВБА, чем аорты. Таким образом, наше исследование показало участие механизмов, связанных с гиперполяризацией мембраны, в ре­гуляции ответа сосудов крыс на АХ. Нарастание азотемии приводит к снижению роли гиперполя­ризации мембраны в процессах вазодилятации сосудов, предварительно сокращенных фенилэфрином, в ответ на воздействие АХ.

Таким образом, экспериментальное уменьше­ние количества функционирующих нефронов на длительных сроках наблюдения (4 месяца после НЭ) приводит к снижению вызванной АХ релак­сации фрагментов аорты и ВБА, предварительно сокращенных фенилэфрином. Выявлено также снижение роли NO и гиперполяризации мембра­ны в процессах вазорелаксации у крыс после НЭ.

ОБСУЖДЕНИЕ

Согласно полученным в настоящем исследова­нии данным, сокращение массы паренхимы почек у экспериментальных животных приводит к разви­тию закономерных функциональных и метаболи­ческих проявлений ХБП. Так, через 4 месяца после НЭ у крыс происходит нарастание уровня мочеви­ны крови. Азотемия сопровождается ростом арте­риального давления и массы миокарда. Это ука­зывает на негативное влияние ХБП на сердечно­сосудистую систему. Патологическое влияние НЭ на функционирование сосудов подтверждается также результатами наших экспериментов, вы­полненных на фрагментах аорты и ВБА, которые показали снижение регуляторных возможностей исследуемых сосудов после уменьшения количе­ства функционирующих нефронов. Механизмы такого влияния до настоящего времени изучены недостаточно. Исследование показало, что после НЭ повышается исходный тонус сосудов. Его рост сопровождается нарушением процессов регуляции функции ГМК сосудов, выражающемся в сниже­нии величины реакции на действие биологических активных веществ, в частности АХ. Выявленное уменьшение амплитуды вазодилатации на добав­ление в раствор АХ указывает на снижение реак­тивности сосудов, что препятствует реализации полноценного ответа, характерного для сосудов контрольных животных. Однако механизмы такого влияния требуют уточнения.

Существует множество путей, посредством ко­торых возможна тонкая настройка тонуса сосудов в ответ на изменение состояния организма. Извест­но, что тонус сосудов регулируется импульсами, приходящими по нервным волокнам, модулирует­ся балансом гормонов в крови и чувствительно­стью рецепторов к ним. Этот органный уровень регуляции кровообращения, несомненно, значим, однако не менее важным является путь, позволяю­щий менять характеристики локального кровотока в сосудах различного калибра. Он связан с функ­ционированием эндотелиальных клеток, высти­лающих внутреннюю поверхность сосуда [19, 20].

В настоящее время эндотелиальная дисфунк­ция рассматривается в качестве одного из основ­ных патогенетических факторов, приводящих к развитию сердечно-сосудистых нарушений при прогрессировании патологии почек. Во многих клинических и экспериментальных исследова­ниях выявлено нарушение эндотелийзависимой регуляции тонуса сосудов как у больных ХБП [21-24], так и у экспериментальных животных [25-27]. Однако конкретные механизмы развития эндотелиальной дисфункции при почечной пато­логии требуют дальнейшего изучения.

Для оценки состояния эндотелиальной регуля­ции сосудов крыс мы использовали сравнение вели­чины ответа сосудистого фрагмента на воздействие вазоактивных агентов. Основным тестирующим ве­ществом был выбран АХ, являющийся мощным вазодилататором, стимулирующим выработку NO че­рез активацию М-холинорецепторов [28-31]. Наши исследования на сосудах in vitro показали, что нефрэктомия приводит к значительному снижению реактивности фрагментов как аорты, так и ВБА в ответ на введение АХ, что указывает на снижение регуляторных возможностей сосудистой системы. Для уточнения механизмов, участвующих в данном процессе, мы провели эксперименты с блокирова­нием отдельных звеньев регуляторной цепочки.

Важным звеном регуляции тонуса сосудов считают механизмы, связанные с синтезом NO [32-34]. Мы предположили, что нефрэктомия будет приводить к нарушению связанных с про­дукцией NO путей регуляции сосудистого тонуса. Предположение основывалось также на наших предыдущих экспериментах, показавших сни­жение уровня NO в сыворотке крови спонтанно-гипертензивных крыс, подвергнутых резекции части почечной ткани [35]. Для уточнения NO- зависимых механизмов влияния НЭ непосред­ственно на эндотелийзависимую регуляцию то­нуса сосудов мы провели тестирование фрагмен­тов сосудов с использованием предварительного ингибирования синтазы NO введением L-NAME. Выявленное в настоящем исследовании снижение вазодилататорного ответа сосудов на АХ в усло­виях ингибирования синтеза NO у крыс после нефрэктомии (по сравнению с контрольными жи­вотными) указывает на повреждение связанных с продукцией NO путей модуляции сосудистого то­нуса. Механизм подобных изменений до сих пор не ясен [34]. Характер сосудодвигательного отве­та может быть обусловлен множеством факторов и, в частности, снижением синтеза NO [36, 37] и уменьшением его биодоступности [25, 38, 39].

Один из путей регуляции тонуса сосудов свя­зывают с развитием гиперполяризации мембраны эндотелия [40, 41]. В этой регуляторной цепочке основная роль отводится эндотелиальным Ca²+- активируемым К+-каналам с различной скоростью проводимости, посредством которых обеспечива­ется распределение ионов К+ в клетках эндотелия [42-44]. Полагают, что гиперполяризация эндоте­лия может напрямую распространяться через ще­левые соединения в ГМК [42, 45] или посредством оттока K⁺ из эндотелия через эндотелиальные Ca²⁺- активированные К+-каналы приводить к гиперпо­ляризации ГМК и, следовательно, к вазодилатации [45]. Блокада одного из этих механизмов модуля­ции величины вазодилатации позволяет оценить их вклад в общую картину вазомоторного ответа сосу­да на внешнее воздействие. Наши исследования по­казали, что в условиях блокады Са²+-активируемых К⁺-каналов большой проводимости (введением ТЭА) амплитуда ответа на АХ значимо снижалась как у НЭ, так и у контрольных животных, что под­тверждает участие этого механизма в ответных реакциях сосудов на АХ. Однако НЭ сопровожда­лась уменьшением степени дилатации сосудистых сегментов на воздействие АХ при предваритель­ной обработке их ТЭА. Следовательно, удаление 5/6 массы почек приводит к нарушению связанных с гиперполяризацией мембраны эндотелиальных клеток путей регуляции тонуса сосудов.

Результаты наших исследований согласуются с имеющимися в литературе данными о сниже­нии вазодилатирующей способности сосудов жи­вотных, подвергнутых уменьшению количества функционирующих нефронов [27, 46]. Механизмы выявленных нарушений полностью не ясны, по­скольку, с одной стороны, эндотелиальная регу­ляция тонуса сосудов является мультифакторным процессом, а с другой - развитие ХБП приводит к дисбалансу различных вазоактивных метаболитов, влияющих на функцию сосудов [21, 25, 46, 47].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проведенные исследования по­казали, что резекция 5/6 массы ткани почек у крыс вызывает снижение реактивности сосудов, связан­ное как с нарушением NO-зависимых путей, так и понижением уровня гиперполяризации клеток эндотелия. Такое снижение реактивности может приводить к дизрегуляции сосудистого тонуса, повышению сосудистого сопротивления, росту арте­риального давления, неадекватному ответу сосудов на воздействия биологически активных агентов и, таким образом, запускать патогенетические меха­низмы развития осложнений сердечно-сосудистой системы при ХПБ. Важность решения проблемы предупреждения и коррекции нарушений сосуди­стой системы при развитии почечной патологии требует дальнейшего более детального изучения.

Работа поддержана Грантом РФФИ 19-015-0047.

Работа выполнена с использованием животных из биоколлекции ИФ РАН.