ФОТОФЕРЕЗ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ПОЧЕК

ВВЕДЕНИЕ

Отторжение почечного аллотрансплантата (ПАТ), несмотря на совершенствование схем им­муносупрессии, остается ведущей причиной дис­функции трансплантата. Приблизительно 5-10% реципиентов в течение 1 года после пересадки почки возвращаются к программам гемодиализа в связи с дисфункцией ПАТ [1], а с удлинением времени после трансплантации таких пациентов становится все больше [2]. Постоянный прием иммуносупрессантов связан с наличием таких осложнений, как гипертония, сахарный диабет, повышенный риск развития инфекций, онкогенез, к тому же, обладая нефротоксичным действием, эти препараты приводят к постепенному угаса­нию почечной функции [3, 4]. Совершенно другой подход к решению этой проблемы заключается в формировании иммунологической толерантно­сти, при котором иммунная система реципиента избирательно не реагирует на ткани транспланта­та при сохранении своих базисных функций - раз­вития воспалительных реакций ко всем остальным чужеродным антигенам. Существуют много инте­ресных методов и подходов к достижению имму­нологической толерантности, из которых наиболее перспективным является экстракорпоральная фо­тохимиотерапия (ЭФХТ) или фотоферез.

Экстракорпоральная фотохимиотерапия

ЭФХТ или фотоферез - это метод лечения, в основе которого лежит воздействие активирован­ных ультрафиолетовым светом молекул 8-меток- сипсоралена на лимфоциты пациента, предвари­тельно полученные методом лейкоцитафереза, и после возвращенные ему обратно. Впервые метод ЭФХТ был успешно проведен в 1987 г. группой уче­ных Йельского университета во главе с профессо­ром R.Edelson в качестве терапии Т-клеточной лимфомы кожи [5]. Дальнейшее использование метода показало высокую эффективность при терапии псо­риаза [6], системной склеродермии [7], вульгарной пузырчатки [8] и ряда других заболеваний [9-12].

ЭФХТ показала высокую эффективность в ле­чении реакции отторжения при трансплантации солидных органов. Так, Costanzo-Nordin и соавт. [13] продемонстрировали, что лечение фотоферезом купировало острое отторжение сердца у 8 из 9 пациентов, развившееся на 4-6-й месяц после пересадки. Анализ гистологического исследования эндомиокардиальной биопсии, взятый до проведе­ния фотофереза и на 7-е сутки после курса лечения, показал значительное снижение инфильтрации трансплантата Т-лимфоцитами, В-лимфоцитами и макрофагами. Дальнейшее наблюдение за па­циентами в течение 6 мес, не выявило каких-либо повторных эпизодов отторжения. Barten и соавт. [14] включили ЭФХТ в стандартный протокол им­муносупрессии при трансплантации сердца и об­наружили снижение частоты развития острого от­торжения трансплантата, почечной васкулопатии, а также цитомегаловирусной инфекции (ЦМВ). Ав­торы предполагают, что введение такого комбини­рованного протокола при подборе индивидуальной дозы ЭФХТ в дальнейшем поможет значительно снизить прием иммуносупрессантов [14, 15].

При трансплантации гемопоэтических стволо­вых клеток ЭФХТ показала высокую эффектив­ность в лечении стероидрезистентных форм ре­акции трансплантат против хозяина (РТПХ), по­явление которой обычно связывают с плохим про­гнозом выживаемости [16, 17]. В нашей стране А.В. Козлов и соавт. [18] применили ЭФХТ у 114 больных с РТПХ при поражении слизистых обо­лочек, легких, печени, кишечника. Авторы обна­ружили несколько лучший ответ на данную про­цедуру при лечении хронической формы РТПХ, чем при острой форме. Общая 3-летняя выживае­мость больных с хронической РТПХ в случае по­ложительного ответа на терапию ЭФХТ состави­ла 80%, а при отсутствии ответа - 35%; больных с острой РТПХ при положительном ответе - 43%, а при отсутствии его - 12% соответственно. Calore и соавт. [19] в лечении острой РТПХ у 72 детей обнаружили полный ответ на ЭФХТ у 72%, у 11% был частичный ответ и у 17% не было никакого ответа. Общая 5-летняя выживаемость в случае наличия ответа составила 78%, при отсутствии 30%.

Benden и соавт. [20] оценили динамику развития облитерирующего бронхиолита, как предиктора постепенного отторжения легочного трансплантата [21]. Применив ЭФХТ у 12 пациентов при началь­ных стадиях развития облитерирующего бронхиолита в сравнении с контрольной группой из 12 че­ловек, авторы обнаружили эффективность ЭФХТ в уменьшении регрессии объема форсированного выдоха, тем самым продлевая выживаемость транс­плантата, в среднем, на 4,9 года. Jaksch и соавт. [22] применили ЭФХТ у пациентов с тяжелой формой прогрессирующего облитерирующего бронхиолита, что позволило добиться ее регрессии и стабили­зации у 61% пациентов с резистентностью к стан­дартным протоколам иммуносупрессии.

Urbani и соавт. [23] применили ЭФХТ для профилактики отторжения при трансплантации печени. Примечательным является то, что при­менение этого метода позволило безопасно от­срочить у трети реципиентов начало приема ин­гибиторов кальциневрина с целью минимизации нефротоксичности на ранних этапах послеопе­рационного периода. Помимо того, значитель­но удалось снизить риск как клеточного, так и гуморально-опосредованного отторжения при АВ0-несовместимых трансплантациях: при ис­следовании биоптатов ни у одного из реципиен­тов, получавших ЭФХТ, не было зафиксировано признаков острого или хронического отторжения при среднем сроке наблюдения около двух лет [24]. Также у авторов накоплен опыт применения ЭФХТ у реципиентов печени, инфицированных вирусом гепатита С с целью снизить лекарствен­ную иммуносупрессивную нагрузку и повысить эффективность противовирусного лечения ком­бинацией рибавирина и интерферона. В резуль­тате 69% реципиентов завершили курс лечения, а устойчивый вирусологический ответ был достиг­нут у 50% пациентов [23-25].

По сравнению с количеством зарубежных иссле­дований применения ЭФХТ при трансплантации гемопоэтических клеток костного мозга и сердца известны результаты нескольких небольших иссле­дований, посвященных лечению острого отторже­ния ПАТ [26, 27]. В МОНИКИ им. М.Ф. Владимир­ского было проведено исследование профилактиче­ского применения ЭФХТ при аллотрансплантации трупной почки [28]. Модель исследования была по­строена по принципу сравнительного анализа меж­ду двумя группами больных парного ПАТ, в каждой по 20 человек. В одной группе ведение больных проводилось на стандартной иммуносупрессивной терапии, во второй - использовалась комбинация ЭФХТ со стандартной иммуносупрессией. В груп­пе с применением ЭФХТ отмечалось лучшее функ­ционирование трансплантата на 30-е и 180-е сутки, проявляющееся более высокой скоростью клубоч­ковой фильтрации на 47,2% и меньшей степенью протеинурии. Анализ протокольных биопсий на 30-е и 180-е сутки диагностировал острое отторже­ние у 4 пациентов группы контроля (без ЭФХТ), в то время как в группе с ЭФХТ картина биопсии соответствовала остаточным явлениям острого ка­нальцевого некроза, выявленного у всех пациентов в биоптате на 30-е сутки после аллотранспланта­ции трупной почки (АТТП). Авторами проведен анализ иммунологических данных, в результате которого выявлено, что применение ЭФХТ приво­дит к достоверному уменьшению как количества клеток, экспрессирующих коактивационные ре­цепторы CD28 (с 57,7±18,2 до 34,5±11,4%, р<0,05), так и плотности этих рецепторов на наивных хел- перных Т-лимфоцитах (с 22,7±6,0 до 16,8±5,1 ед., р<0,05), увеличению количества эффекторных ци- толитических Т-лимфоцитов в контрольной группе на 17% и снижению на 18,6% в основной группе. Полученные результаты позволили сделать вывод, что применение ЭФХТ приводит к появлению то­лерантности к антигенам гистосовместимости до­норского органа [29].

Механизмы действия фотофереза

Под влиянием процедур ЭФХТ происходит апоптоз аллореактивных Т-клеток [30], который был продемонстрирован Holtick и соавт. [31] в опы­тах in vitro. Сразу после процедуры ЭФХТ лимфо­циты остаются живыми, способными к смешанной лимфоцитарной реакции. Процессы апоптоза на­чинают наблюдаться только спустя несколько ча­сов после ЭФХТ, достигая максимума к 3-му дню. Во время активации иммунной реакции при РТПХ, реакциях отторжения трансплантата и аутоиммун­ных заболеваниях аллореактивный клон являет­ся доминирующим во всей клеточной популяции лимфоцитов и, по-видимому, оказывается более чувствителен к действию ультрафиолетового излу­чения в присутствии 8-метоксипсоралена [32]. Так, Hannani и соавт. [33] обнаружили, что активиро­ванные Т-клетки (аллореактивный клон) при раз­витии отторжения трансплантата более чувстви­тельны к фотоферез-индуцированному апоптозу, чем неактивированные Т-клетки, и в них апаптоз происходит быстрее. У пациентов с Т-клеточной лимфомой кожи Yoo и соавт. [34] через 24 ч после ЭФХТ наблюдали апоптоз клеток только в популя­ции лимфоцитов, включая клетки Сезари, однако моноциты (CD14+CD45+) оставались целыми.

Setterblad и соавт. [35] на примере РТПХ по­казали, что через 48 ч после ЭФХТ моноциты также начинают подвергаться апоптозу, достигая 80% лишь к 6-му дню. Такие моноциты до на­ступления гибели способны к взаимодействию с Т-клетками: презентация молекулами главного комплекса гистосовместимости пептидов, моле­кулы костимуляции CD40 и CD86, а также моле­кулы адгезии CD 11 a, CD54 и CD58 сохранены. Они по-прежнему способны к дифференцировке в дендритные клетки (ДК) под влиянием ГМ-КСФ и ИЛ-4 в течение 6 дней, однако их миграционный потенциал нарушен, что связывают с нарушени­ем экспрессии некоторых молекул, в частности CCR7 (CD197) [36]. После возврата моноцитов пациенту с нарушенными миграционными свой­ствами такие клетки подвергаются апоптозу, как и лимфоциты. Вероятно из всей популяции лим­фоцитов, непосредственно подвергшихся ЭФХТ, принимают участие в формировании толерантно­сти только те клетки, которые в дальнейшем ста­ли ДК. Клетки, подвергшиеся апоптозу, подобно всем некротическим и мертвым клеткам, ответ­ственны за возникновение воспаления и провоци­руют иммунный ответ [32].

Идея использования апоптотических клеток для профилактики и лечения отторжения транс­плантата активно изучается в последние годы. Донорские лейкоциты, подверженные апоптозу, содержат большое количество аллоантигена, который способен вызывать иммунорегуляторный сигнал на антигенпредставляющих клетках (АПК) реципиента и способствовать формирова­нию донор-специфической толерантности [37].

В опытах на мышах при трансплантации кост­ного мозга инъекция донорских апоптотических лейкоцитов предупреждала развитие РТПХ и продлевала жизнь трансплантата [38]. Kleinclauss и соавт. [39] в основе формирования толерантно­сти видят образование Т-регуляторных клеток.

Лимфоциты, моноциты и ДК, чувствительные к апоптозу, возвращаясь обратно к пациенту, ми­грируют в селезенку и печень, где они фагоцитиру­ются АПК. Повышенная экспрессия CD95 (Fas) и CD95-ligand усиливает апоптоз лимфоцитов через 20 ч после ЭФХТ [40]. При этом важным моментом является тот факт, что апоптозу также подвергают­ся воспалительные клетки, инфильтрирующие периваскулярное пространство и интерстиций транс­плантата [41]. Количество таких апоптотических клеток велико в первые сутки после курса ЭФХТ и затем достаточно быстро уменьшается.

Peritt [42], исследуя ДК, поглотившие апоптотические клетки, обнаружил снижение экспрес­сии костимулирующей молекулы CD86 и вторич­ного сигнала ИЛ-12 на их поверхности. Введение апоптотических антител оказывает супрессор­ную активность на АПК, стимулирует выработку ТФР-β, ИЛ-10 и уменьшает синтез провоспалительных цитокинов ФНОа, HR-1a, ИЛ-1Ь, ИЛ-6 и ИЛ-12 [43].

Iyoda и соавт. [44] считают, что ДК после фа­гоцитоза апоптотических клеток являются незре­лыми и неспособны в должной мере экспрессиро­вать свои маркеры (CD40, CD80, CD86 и CD83) и МНС, что делает невозможным их взаимодей­ствие с Т-эффекторными лимфоцитами.

Gorgan и соавт. [45], использовав ЭФХТ в ле­чении 10 пациентов с РТПХ, обнаружили связь между клинической эффективностью фотофереза и увеличением CD3-CD56+ NK-клеток, нормали­зацией соотношения CD4/CD8-клеток, снижен­ной циркуляцией ДК и Т-клеточной пролифера­цией (аутологичной и аллогенной) в МЛР-тесте. Они также заметили переход преимущественной дифференцировки Т-хелперов 1-го типа в сторону Т-хелперов 2-го типа и соответственно переход от ДК 1-го типа к ДК 2-го типа. При этом известно, что Тх2-клетки имеют взаимно перекрестную от­рицательную регуляцию с Тх1 фенотипа, ингиби­руя синтез провоспалительных цитокинов (ИЛ-1 и ФНОа), и могут играть важную роль в разви­тии толерантности. Похожую аналогию выявили Baron et al. [46] в лечении криза отторжения при АТТП.

После фагоцитоза апоптотических клеток ДК осуществляют презентацию антигена при помощи МНС II класса с Т-клеточным рецептором (ТкР) CD4-хелперов - первый коактивационный путь. В дальнейшем, в зависимости от типа ко стиму­лирующего сигнала от CD4+-клеток и состояния микроокружения, при взаимодействии ДК МНС I класса и ТкР CD8+-клеток образуются эффекторные клетки различной направленности [47].

Многие авторы считают, что основная роль в формировании специфической толерантности принадлежит незрелым дендритным клеткам, по­лученным в результате ЭФХТ [48, 49].

В МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского была предложена несколько иная модель формирова­ния толерантности в ходе проведения ЭФХТ [29]. В основе этой модели лежит изменение костимулирующего рецептор-лигандного взаимодействия в процессе презентации донорских антигенных пептидов наивным Т-лимфоцитам. Костимуляция Т-лимфоцитов состоит в том, что клетка в дополнение к сигналу, индуцированному через Т-клеточный рецептор, получает второй сигнал, усиливающий пролиферацию и стимулирующий эффекторные функции Т-клеток. В костимуляции принимают участие многие молекулы, однако наиболее значимая роль в этом процессе принад­лежит взаимодействию B7-CD28/CTLA-4. В ходе иммунологического исследования при использо­вании ЭФХТ у больных после АТТП происходило достоверное снижение плотности экспрессии ре­цепторов коактивации CD27 и CD28 на наивных Т-лимфоцитах в отличие от контрольной группы, где данная процедура не проводилась. Экспрессия молекулы CTLA-4 на наивных Т-лимфоцитах в этих двух группах не отличалась. Так как во взаи­модействии с лигандами B7 (CD80, CD86), пред­ставленных на АПК, принимают участие молеку­лы CD28 и CTLA-4 на наивных Т-лимфоцитах, то в ходе проведения ЭФХТ происходит смещение костимулирующего сигнала в сторону CTLA-4, ответственного за формирование ингибирую­щего сигнала на эффекторные аллореактивные Т-клетки и возникновение толерантности.

Vogel et al. [50] в опытах на мышах при моду­ляции рассеянного склероза изучали влияние бло­кирования лиганда B7 и избирательного блокиро­вания CTLA-4 на формирование Т-регуляторных клеток (Tregs). В результате было обнаружено, что блокада B7 и CTLA-4 усугубляет признаки заболевания, провоцируя более тяжелое воспале­ние ЦНС и демиелинизацию, что было связано с повышенным производством провоспалительных цитокинов IL-17 и ИФН-γ. В группе блокирования CTLA-4 в дополнение возникало снижение пере­ходного маркера клеточной пролиферации Ki67, экспрессии CTLA-4 и функции Tregs. Таким обра­зом, в отсутствие Tregs происходили увеличение эффекторной функции Т-лимфоцитов и дальней­шее прогрессирование заболевания.

Основная роль в поддержании перифериче­ской толерантности принадлежит Tregs, которая была подтверждена многочисленными исследова­ниями [51, 52].

Помимо Tregs-клеток, в формировании пери­ферической толерантности принимают участие целый набор клеток, в котором один тип клеток способен контролировать активацию другой по­пуляции. Среди них можно выделить Т-клетки, обладающие супрессорной активностью, вклю­чающие натуральные CD4+CD25+ Т-клетки, TGFp секретирующие Т-клетки, индуцированные Тх3, TGF-β и ИЛ-10, секретирующие Т-клетки, акти­вированные Тх1 и некоторыми CD8 Т-клетками и NK-клетками. Многочисленные исследования показали, что CD4+CD25+ может предотвратить активацию аутореактивных Т-клеток и развитие аутоиммунных заболеваний. Сосуществование клеточных маркеров CD4 и CD25 (а-цепи рецеп­тора IL-10) в одиночку не может представлять су­прессорную субпопуляцию, поскольку большая часть CD4+-клеток (20-40%) выражают средний уровень CD25 (CD25int) и не обладают должной активностью. Только небольшая популяция (0,8­1%) выражает высокие уровни CD25 (CD25hi), ко­торая на самом деле является истинной Tregs [53].

Другим маркером, который может помочь идентифицировать Tregs, является Foxp3 (80% Foxp3+-клеточные Т-регистры) [54].

Супрессорная активность Tregs обычно зави­сит от активации их ТкР (т.е. является антигензависимой), которая препятствует пролиферации CD4 + Т-клеток, а также снижает синтез провоспалительных цитокинов и способна подавлять действие CD8+-клеток, дендритных клеток, В-клеток и NK-клеток. Роль Tregs активно была продемонстрирована в моделях рассеянного скле­роза [55].

Влияние роли Tregs также была доказано в об­ласти трансплантации. Передача CD25+-клеток у мышей, толерантных к коже трансплантата, дру­гой группе мышей вызывает специфическую то­лерантность [56].

При пересадке костного мозга первая демон­страция роли Tregs была обнаружена в ускорении развития РТПХ-осложнений при транспланта­ции гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и Т-клеток донора, обедненных Tregs-клетками, ко­торые вводили пациенту после тотальной химио­терапии [57].

Rubegni и соавт. [58] сообщили об увеличении CD4+CD25hi-лимфоцитов у 14 больных с хрони­ческой РТПХ, возникающей через 48 ч после про­ведения ЭФХТ, а также через 6 и 12 мес.

В другом исследовании у 6 пациентов после пересадки легких также отмечалось увеличении CD4+CD25hi Т-клеток после проведения курса ЭФХТ [59].

Многочисленные исследования в области ме­ханизмов действия и высокой клинической эффек­тивности позволили рекомендовать ЭФХТ в каче­стве терапии второй линии в профилактике и лече­нии трансплантационных отторжений [10, 11, 32].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Посттрансплантационный период ведения больных всегда сопряжен с большим риском раз­вития отторжения почечного аллотрансплантата. Совершенствование протоколов иммуносупрессии помогло значительно отодвинуть сроки позднего отторжения, однако их прием сопряжен с различ­ными осложнениями: высоким риском смертности от сердечно-сосудистых заболеваний, развитием инфекций, онкозаболеваний, сахарного диабета, медикаментозной нефротоксичностью и т.д. По­стоянно увеличивающееся количество пациентов, нуждающихся в трансплантации, снижает шанс на повторную трансплантацию, поэтому весьма пер­спективной задачей является продление сроков и качества функционирующих трансплантатов.

Формирование иммунологической толерант­ности к трансплантату - совершенно иной подход к борьбе с отторжением ПАТ. При ее достижении станет возможным полностью или частично отка­заться от иммуносупрессантов, что поможет избе­жать осложнений, связанных с их применением.

Среди множества методов достижения имму­нологической толерантности наиболее перспек­тивным является эфферентная фотохимиотерапия, или фотоферез. Данный метод показал высокую эффективность в лечении кризов острого и хро­нического отторжения при трансплантации со­лидных органов и гемопоэтических стволовых кроветворных клеток (СКК). Высокая клиническая эффективность фотофереза, прежде всего, характе­ризуется отсутствием усиления иммуносупрессии, при проведении данного метода не было выявлено каких-либо специфических осложнений. Много­центровые исследования, посвященные использо­ванию этого метода при трансплантации сердца, легких и СКК, позволили рекомендовать данный метод в качестве терапии 2-й линии при развитии отторжения трансплантированных органов [10, 11].

При анализе мировой литературы обнаружено небольшое количество публикаций, посвященных профилактическому применению ЭФХТ в ран­нем посттрансплантационном периоде [23, 28]. Их результаты показали значительное улучше­ние выживаемости и функционирования транс­плантатов при снижении различных осложнений в ближайшем посттрансплантационном периоде. По-прежнему остаются неясными длительность и полнота формирования толерантности в отдален­ном периоде. Остаются вопросы в определении эффективной дозы ЭФХТ. Не изучены также во­просы о необходимости проведения дополнитель­ных процедур для поддержания толерантности и существуют ли возможности, критерии для сни­жения иммуносупрессии.