ОЦЕНКА УРОВНЕЙ НЕФРИНА И ПОДОЦИНА В МОЧЕ У БОЛЬНЫХ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ

ВВЕДЕНИЕ

Во многих развивающихся и в большинстве развитых стран мира наблюдается стремитель­ный рост заболеваемости сахарным диабетом (СД), что позволило в настоящее время говорить о пандемии этой болезни. Так, по опубликован­ным в 2015 г. данным Международной федера­ции диабета (IDF), в мире 415 миллионов людей в возрасте 20-79 лет страдают СД, через 20 лет прогнозируют увеличение этого количества до 640 миллионов (на 55%) [1]. Согласно Российско­му Государственному регистру больных с СД, на январь 2015 г. в нашей стране по обращаемости в лечебные учреждения насчитывается 4095 мил­лиона больных, что составляет 2,8% населения РФ [2]. За последние 5 лет распространенность СД в РФ увеличилась на 23%, главным образом за счет СД 2-го типа, причем более чем у поло­вины этих больных СД ранее не был диагности­рован [2, 3]. Между тем, результаты контрольно­эпидемиологических исследований, проведенных ФГБУ Эндокринологический научный центр, по­казали, что истинная распространенность СД в России, выявленная в разных возрастных группах при активном скрининге, приблизительно в 2-3 раза превышает официально зарегистрирован­ную, что составляет около 10 миллионов человек (7% населения нашей страны) [4]. Россия входит в десятку стран-лидеров по заболеваемости СД, за­нимая в этом рейтинге пятую позицию [1].

Одним из наиболее опасных последствий СД, причиной инвалидизации и высокой смертности является диабетическая нефропатия (ДН), зани­мающая ведущие позиции в структуре терминаль­ной почечной недостаточности (тПН) у больных на заместительной почечной терапии [1, 5]. В Рос­сии при общей заниженной частоте регистрируе­мых осложнений СД распространенность нефро­патии недооценивается особенно серьезно. Так, при активном скрининге у больных СД 2-го типа частота выявления ДН в 6 раз превысила реги­стрируемую в общей популяции СД 2-го типа [2].

Значительная распространенность СД, высокий риск развития и тяжесть связанных с этим заболе­ванием сосудистых осложнений (в частности ДН), растущее бремя финансовых затрат на их лечение, бесспорно, представляют серьезные проблемы для здравоохранения разных стран. В этой связи осо­бую актуальность приобретает раннее выявление нефропатии с целью своевременного начала нефропротекции и отдаления развития тПН.

Единственным используемым в рутинной практике методом ранней диагностики ДН яв­ляется определение уровня альбуминурии (АУ). Было показано, что АУ коррелирует с выражен­ностью морфологических изменений в почках [6]. Экскреции альбумина с мочой в количестве от 30 до 300 мг/сут (30-300 мг/г креатинина мочи), ранее называемая микроальбуминурией (МАУ), длительное время считалась маркером, отражаю­щим начальные функциональные и структурные изменения в почке при СД. Однако проведенные к настоящему времени исследования доказали, что характерные для СД экспансия мезангия, увеличение толщины гломерулярной базальной мембраны и объёма клубочков обнаруживаются и при меньших значениях АУ (<30 мг/сут или < 30 мг/г креатинина мочи); при МАУ эти измене­ния более выражены, и в части клубочков уже мо­жет выявляться гломерулосклероз, появление же стойкой протеинурии (ПУ) свидетельствует о по­тере около 50-70% клубочков [5-8]. Градация АУ и определение ее диагностического уровня стали предметом длительной дискуссии. Согласно со­временным международным и отечественным рекомендациям, при сохранении прежних числен­ных значений МАУ сегодня называют «высокой АУ» (подчеркивая, что это уже клинически зна­чимый, а не самый ранний признак), для уровня АУ <30 мг/сут, традиционно считавшегося «нор- моальбуминурией», предложено определение «повышенная АУ», «оптимальной» считают АУ <10 мг/сут [8-10]. Анализ рандомизированных исследований (HOPE, LIFE, Framingham Heart Study и др.) показал, что МАУ и так называемая «low-grade albuminuria», как отражение генерали­зованной дисфункции эндотелия сосудов, тесно связаны с повышением риска развития сердечно­сосудистых катастроф и смертности от любых причин даже в популяции населения без СД и артериальной гипертензии (АГ). Поэтому значи­мость повышения АУ для диагностики субкли- нического течения ДН далеко не абсолютна. Все вышеизложенное определяет актуальность поис­ка более информативных и специфичных ранних маркеров поражения почек при СД.

Цель исследования: определить величину экс­креции с мочой структурно-функциональных бел­ков подоцитов (нефрина и подоцина) и уточнить значение данных мочевых показателей как ранних маркеров субклинического течения ДН у больных с СД с разной степенью выраженности АУ/ПУ

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследование включены 74 пациента с диа­гнозом СД, в том числе, 30 - с СД 1-го типа и 44 - с СД 2-го типа, из них 37 (50%) мужчин, 37 (50%) женщин в возрасте от 18 до 80 лет. Средний воз­раст больных с СД 1-го типа составил 36,9±17 лет, длительность основного заболевания - 18,4±13 лет. Средний возраст обсследуемыых с СД 2-го типа составил 60,5±10 лет, длительность заболева­ния - 11,5±7,5 лет. Пациенты находились на обсле­довании и лечении в ФГБУ Эндокринологический научный центр (ЭНЦ) МЗ РФ, в клинике нефроло­гии, внутренних и профессиональных заболеваний им. Е.М. Тареева ПМГМУ им. И.М. Сеченова. В группу контроля вошли 10 здоровых добровольцев (4 мужчины, 6 женщин в возрасте от 19 до 77 лет).

Из исследования исключали пациентов: с декомпенсированным СД (уровень гликозилированного гемоглобина HbA1c >10%); ПУ более 2 г/сут; выраженной дисфункцией почек (СКФ<15 мл/ мин/1,73 м²); острым воспалительным заболева­нием любой этиологии на момент исследования; острым или хроническим гломерулонефритом; ишемической болезнью почек; онкологической патологией, системными васкулитами, амилоидозом, сердечной недостаточностью III-IV ст. (по NYHA), острым нарушением мозгового кровоо­бращения, тяжелой артериальной гипертензией 3 степени, беременных.

Всем больным было выполнено клиническое обследование, включавшее сбор анамнеза, осмотр с определением индекса массы тела (ИМТ, кг/м²), общеклинические анализы крови и мочи, концен­трации альбумина в утренней порции мочи иммунотурбидиметрическим методом, рассчитано соотношение концентрации альбумина к креатинину мочи (мг/г креатинина мочи), в сыворотке крови оценены концентрация глюкозы, уровень HbA1c, креатинина, произведен расчет СКФ по формуле CKD-EPI, выполнено УЗИ почек для оценки их размеров и исключения аномалии раз­вития, нефролитиаза.

Специальным методом исследования явилось определение в утренней порции мочи уровня структурно-функциональных белков подоцитов - нефрина (n=74) и подоцина (n=70) - с по­мощью наборов для иммуноферментного анализа («ELISA Kit») производства «CUSABIO» (China) с расчетом концентрации на единицу креатинина мочи в исследованном образце.

Результаты исследования маркеров подоцитар- ного повреждения сравнивали в группах больных с СД, различающихся по выраженности альбуминурии/протеинурии [8]:

I группа (n=41) - пациенты с СД 1-го и 2-го типа с АУ < 30 мг/гСг (A1);

II группа (n=13) - пациенты с СД 1-го и 2-го типа с АУ 30-300 мг/гСг (А2);

III группа (n=20) - пациенты с СД 1-го и 2-го типа с ПУ.

Артериальная гипертензия (АГ) наблюдалась у 52 из 74 (70%) обследованных, преимущественно у больных с СД 2-го типа. Коррекция АГ прово­дилась с помощью ингибиторов АПФ, блокаторов кальциевых каналов. ХБП 1 стадии выявлена у 41 обследованного пациента, ХБП 2 стадии - у 25, ХБП 3 стадии - у 8 человек.

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием пакета прикладных статистических программ «STATISTICA 10,0» («StatSoft», США). При анализе уровней медиа­торов в моче, имеющих отличное от нормального распределение, оценивали медиану, разброс вели­чин по отношению к медиане характеризовали по­казателем интерквартильного размаха [25; 75%], куда входят 50% всех полученных значений. При сравнении двух групп использовали непараметри­ческий критерий Манна-Уитни. Для выявления и оценки связей между исследуемыми показателя­ми применяли непараметрический корреляцион­ный анализ по методу Спирмена. Достоверность различий частот в двух группах оценивали с по­мощью критерия χ² с поправкой Йетса. Нулевую статистическую гипотезу об отсутствии различий и связей отвергали при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Показатели нефринурии (НУ) и подоцинурии (ПДУ), превышающие по уровню 75-й перцентиль в контрольной группе (т.е. практически не встре­чающиеся у здоровых), мы принимали за «поло­жительные» значения (НУ+ >5,84 нг/мл/г; ПДУ+ >1,73 нг/мл/г). НУ+ выявлялась, в среднем, у 69% (52 из 74) больных с СД: у 63% (26 из 41) паци­ентов с АУ <30 мг/г (A1), у 77% (10 из 13) - с АУ 30-300 мг/г (А2) и у 80% (16 из 20) - с ПУ (рис. 1).

ПДУ+ выявлялась у 74% (31 из 70) общей груп­пы больных с СД, в том числе, у 78% (31 из 40) пациентов I группы (А1), у 54% (7 из 13) - из II группы (с А2) и у 83% (52 из 70) больных из III группы (с ПУ) (рис.2). Больные с СД1 и СД2 ти­пов с НУ+ и ПДУ+ в каждой подгруппе распреде­лились практически равномерно (см. рис. 1, 2).

Средний уровень НУ в подгруппах больных с альбуминурией А1 и А2 не различался меж­ду СД 1-го и 2-го типов (7,06 [5,98;7,22] и 7,03 [6,07;7,82] нг/мл/г - СД1 и СД2 с альбуминурией А1 соответственно, р>0,05; 9,56 [7,66;9,56] и 6,91 [6,73;7,06] нг/мл/г - СД1 и СД2 с альбуминури­ей А2 соответственно, р>0,05), что, по-видимому, отражает общность механизмов повреждения подоцитов при диабете. При клинически явной ДН, протекающей с ПУ, экскреция нефрина с мочой была достоверно выше, чем в подгруппе с альбу­минурией А1 (таблица).

У пациентов с СД1 типа с ПУ нефринурия до­стоверно превышала таковую у больных СД2 типа (8,67 [8,04;9,93] и 7,46 [7,38;7,68] нг/мл/г соответ­ственно, р<0,05).

Средний уровень ПДУ в под­группах больных с альбуминурией А1 и А2 и с ПУ был одинаково вы­сок (таблица) и не различался между СД 1 и 2 типов (2,5[2,1;2,86] и 2,7 [2,4;3,01] нг/мл - СД1 и СД2 с альбу­минурией А1 соответственно, р>0,05; 2,05[2,03;2,45] и 2,6 [2,0;3,27] нг/мл/г - СД1 и СД2 с с альбуминурией А2 со­ответственно, р>0,05; 2,6 [2,12;3,09] и 2,8 [2,2;4,24] нг/мл/г - СД1 и СД2 с ПУ соответственно, р>0,05).

У пациентов с СД 1 типа выявлена прямая корреляция НУ с выраженно­стью АУ (R=0,47, р<0,05), эта связь была более выраженной у больных с альбуминурией А2 (R=0,947, р<0,05). Наиболее сильной и достоверной была взаимосвязь НУ с ПУ (R=0,953, р<0,01).

Показатели НУ и ПДУ у больных с СД 1-го типа прямо коррелировали с уровнем креатинина сыворотки кро­ви (R=0,489, р<0,05 и R=0,468, р<0,05 соответственно) и обратно - со СКФ (R=-0,461, р<0,05 и R=-0,36, р<0,05 соответственно), что отражает роль подоцитарного повреждения не толь­ко в нарушении проницаемости гло­мерулярного фильтра, но и в развитии гломерулосклероза и формировании дисфункции почек. На это указывает и выявленная нами прямая взаимос­вязь между уровнем НУ и длительно­стью СД, которая была достоверной и имела наибольшую силу у пациентов с СКФ менее 60 мл/мин независимо от типа диабета (R=0,73, р<0,05).

У пациентов с длительностью СД1 и СД2 менее 5 лет НУ прямо корре­лировала с показателем гликозилированного гемоглобина НвА₁с (R=0,84, р<0,01).                             

На величину показателя НУ при разной дли­тельности диабета оказывала влияние АГ. Это более четко прослеживалось у больных с СД 2-го типа, у которых АГ выявлялась не только в процессе развития ДН, но часто предшествова­ла развитию патологии почек. У данной катего­рии больных нами выявлена прямая достоверная связь систолического артериального давления с выраженностью экскреции нефрина с мочой (R=0,33, р<0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ

В последние десятилетия предметом при­стального внимания и научных исследований в нефрологии являются подоциты и их участие в патогенезе различных протеинурических форм поражения почек не только наследственных, но и приобретенных, в том числе ДН.

Предпосылками к такому направлению иссле­дований послужили экспериментальные работы, продемонстрировавшие важную роль подоцитов в поддержании нормальной структуры и функции почечного клубочка и ключевое значение этих нарушений в развитии ПУ и прогрессировании гломерулосклероза [11-14]. В ранее опубликован­ном обзоре мы подробно осветили структурные и функциональные изменения подоцитов, ассо­циированные с метаболическими, эндокринными и гемодинамическими расстройствами при СД, ознакомили с результатами современных экспери­ментальных и клинических исследований по дан­ным вопросам [15]. В частности было показано, что воздействие на подоциты гипергликемии, ко­нечных продуктов гликозилирования (КПГ), ком­понентов активированной ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), внутриклубочковой гипертензии, оксидативного стресса и других факторов приводит к повреждению ком­плекса адгезивных белков, закрепляющих подо­циты на базальной мембране клубочка (БМК), к перестройке актинового цитоскелета с развитием эффекта сглаживания подоцитарных отростков, усиленному апоптозу подоцитов с последующим их отслоением от БМК и экскрецией с мочой как целых клеток (подоцитурия), так и отдельных подоцитарных белков (нефрина, подоцина и др.) [16-21]. Важно, что ультраструктурные и функ­циональные нарушения в подоцитах предшеству­ют повышению альбуминурии и могут обнаружи­ваться даже при непродолжительном течении СД, что определяет еще один важный аспект изучения маркеров подоцитарной дисфункции - для ранней диагностики и мониторирования течения ДН.

По нашим данным, высокая экскреция мар­керов подоцитарного повреждения отмечалась у части пациентов уже при альбуминурии < 30 мг/г, а при развитии МАУ и особенно ПУ частота об­наружения высокой нефрин- и подоцинурии на­растала. Ожидаемо, что наиболее высокие пока­затели НУ выявлялись у пациентов с ПУ, отражая более выраженные изменения в подоцитах при клинически явной ДН. Полученные нами резуль­таты согласуются с другими исследованиями, свидетельствующими о вовлечении подоцитов в процессы инициации почечного повреждения при СД. В частности, А. Patari и соавт. [22] провели кросс-секционное исследование у больных с СД

1-го типа и выявили методом иммуноблоттинга НУ у 30% больных СД с нормоальбуминурией (в нашем исследовании соответствует АУ А1), у 17% - с МАУ (в нашем исследовании соответ­ствует АУ А2), у 28% - с ПУ, тогда как в моче здоровых лиц нефрин не определялся. В работе В. Jim [23] НУ выявлялась у 54% больных с нормо­альбуминурией и у всех больных СД 2-го типа с ПУ и МАУ. Как и в нашем исследовании, средний уровень экскреции нефрина с мочой у пациентов с МАУ и особенно с ПУ достоверно превышал та­ковой у пациентов с меньшей величиной АУ.

Повышенные концентрации глюкозы, воздей­ствуя на подоциты, активируют экспрессию в них коллагена IV типа и фибронектина, подавляют механизмы расщепления внеклеточного матрикса (снижают продукцию матриксной металлопротеиназы 2-го типа и увеличивают продукции её тканевого ингибитора), что в целом способствует утолщению БМК [24]. Гипергликемия вызывает реорганизацию актиновых фибрилл в цитосклете подоцита с нарушением архитектоники его тела и ножек, способствуя таким образом развитию АУ/ ПУ [24]. Одним из основных механизмов, посред­ством которых гипергликемия оказывает повреж­дающее действие на структуры почки, в том числе подоциты, является неферментативное гликозилирование белков с образованием токсичных про­дуктов. Наибольшее повреждающее действие ока­зывают КПГ. Они образуются в организме боль­ного с СД довольно быстро, в течение нескольких месяцев, после чего даже тщательная компенса­ция гликемии уже не способна полностью устра­нить присутствие этих веществ. Именно необра­тимостью КПГ объясняют продолжающееся про­грессирование сосудистых осложнений даже при хорошей компенсации СД. Подоциты являются мишенью для КПГ, о чем свидетельствует экс­прессия ими соответствующих рецепторов. Так, in vitro в культуре подоцитов экспериментальных животных с СД и подоцитов пациентов с СД было продемонстрировано снижение ими экспрессии нефрина под воздействием гликированного аль­бумина, который проявлял свои эффекты при соединении с рецепторами КПГ [25]. Экспрес­сию рецепторов КПГ в подоцитах активирует не только гипергликемия, но и ангиотензин-II (АТ-II) через АТ₂-рецепторы [25]. Эти сигнальные пути могут представлять дополнительный интерес как потенциальный объект воздействия препаратов, блокирующих РААС, с точки зрения уменьшения токсических эффектов КПГ.

По нашим данным, у пациентов с СД 1-го и СД 2-го типов с длительностью заболевания не бо­лее 5 лет выявлялась сильная высокодостоверная взаимосвязь НУ с уровнем гликозилированного гемоглобина, что также указывает на ключевую роль гипергликемии в формировании подоцитарной дисфункции даже при непродолжительном течении СД и подчеркивает необходимость дости­жения оптимального контроля гликемии для про­филактики развития и нарастания тяжести ДН.

По современным представлениям, повреж­дающее воздействие на подоциты оказывает си­стемная, а также внутриклубочковая гипертензия, что было продемонстрировано при ДН и гипер­тоническом нефроангиосклерозе [26-29]. Уста­новлено, что длительное воздействие мощного гидравлического пресса приводит к механическо­му растяжению подоцитов, нарушению синтеза адгезивных белков, снижению экспрессии ряда структурных подоцитарных белков [30]. Введе­ние ангиотензина в эксперименте у крыс, помимо развития АГ, сопровождалось апоптозом подоцитов и уменьшением экспрессии нефрина [31]. Кроме того, в эксперименте показано, что подоциты сами являются одним из источников синтеза компонентов РААС в почке. Высокие концентра­ции глюкозы и механическое растяжение индуци­руют синтез АТ-II подоцитами через активацию экспрессии ангиотензиногена. Под воздействием повреждающих факторов подоциты экспресси­руют АТ₁- и АТ₂-рецепторы, приобретая, таким образом, способность отвечать на действие цир­кулирующего АТ-II. Помимо гипергликемии и механического растяжения, продукцию АТ-II в подоцитах активируют трансформирующий фак­тор роста-β1, реактивные кислородные радикалы, компоненты ПУ [32, 33].

В нашем исследовании достоверная взаимос­вязь АГ с выраженностью экскреции нефрина с мочой выявлялась у больных с СД 2-го типа, при СД 1-го типа она не достигла уровня статистиче­ской значимости, что, как мы полагаем, связано с большей частотой обнаружения АГ именно в группе больных с СД 2-го типа. Больные с СД 2-го типа были старше, многие из них уже имели АГ к моменту развития у них ДН.

Экспериментальными исследованиями по­следних лет было убедительно показано, что повреждение подоцитов имеет первостепенное значение не только в нарушении проницаемости фильтрационного барьера и развитии ПУ, но и в формировании гломерулосклероза и нарушении функции почек [13]. При интенсивном или про­должительном воздействии повреждающих фак­торов происходит значительное слущивание подоцитов в мочевое пространство, что при ограни­ченной пролиферативной способности этих кле­ток приводит к подоцитопении. На месте потери подоцита БМК оголяется, сращивается с капсулой Шумлянского-Боумена, формируя очаги гломерулосклероза. Кроме того, в процессе повреждения подоциты утрачивают способность экспрессиро­вать специфические подоцитарные белки, меняют эпителиальный фенотип и начинают экспресси­ровать маркеры мезенхимальных клеток. Подоб­но фибробластам, трансдифференцированные подоциты приобретают способность продуцировать матриксные белки (фибронектин, коллаген и др.), ускоряя таким образом формирование гломерулосклероза и нарушение функции почек [13, 34, 35].

На важную роль подоцитарной дисфункции в механизмах прогрессирования ДН косвенно указывают и результаты нашего исследования. Так, у пациентов с СД с разной выраженностью АУ/ПУ показатель экскреции с мочой нефрина прямо коррелировал с уровнем креатинина в сы­воротке крови и обратно - с СКФ, а у пациентов со стойким снижением СКФ менее 60 мл/мин выявлялась сильная прямая взаимосвязь между уровнем нефринурии и длительностью СД, что отражает причинно-следственную взаимосвязь пролонгированного повреждения подоцитов при длительном течении СД с развитием дисфунк­ции почек.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, у большинства (от 63 до 74%) больных с СД выявляется высокая экскреция с мо­чой маркеров повреждения подоцитов (нефрина, подоцина), предшествующая развитию клиниче­ски значимой альбуминурии и ПУ, что позволяет использовать данные мочевые тесты для ранней доклинической диагностики гломерулярного по­вреждения при СД.

Тесные корреляции уровня в моче биомаркеров подоцитарной дисфункции (в большей степени нефринурии) с клиническими проявлениями по­ражения почек (выраженностью альбуминурии/ протеинурии, артериальной гипертонии, почеч­ной дисфункции), а также уровнем гликозилированного гемоглобина крови раскрывают перспек­тивы применения изученных мочевых тестов для неинвазивного мониторирования развивающихся при СД гломерулярных изменений и оценки риска их прогрессирования.