ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ NGAL, БЕЛКОВ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА С3 И С4, ИММУНОГЛОБУЛИНОВ КРОВИ У ДЕТЕЙ С ГЕМОЛИТИКО-УРЕМИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ

ВВЕДЕНИЕ

Гемолитико-уремический синдром (ГУС) наи­более частая причина острого повреждения почек (ОПП) у детей раннего возраста. ГУС - клинико­лабораторный симптомокомплекс, включающий микроангиопатическую гемолитическую анемию, тромбоцитопению и ОПП [1].

В настоящее время ГУС подразделяется на 2 группы:

1. ГУС, индуцированный инфекцией:

• типичный ГУС, вызванный шига- (STEC) или и веротоксин- (VTEC)
• продуцирующими бактериями, или про-

дуцирующим нейраминидазу Streptococcus рпеитошае,

2. Атипичный ГУС, обусловленный генетиче­скими нарушениями или изменениями иммунной системы, приводящими к патологии системы ком­племента:

Первая группа заболеваний в структуре при­чин ГУС составляет 90-95% и в подавляющем числе случаев развивается на фоне диареи, поэто­му часто обозначается термином ГУС Д «+» (ти­пичный, диарея-ассоциированный ГУС) до точ­ного установления его этиологии [2, 3].

Острое повреждение почек (ОПП) является неотъемлемой частью ГУС. Согласно рекоменда­циям KDIGO (Clinical Practice Guidelines for Acute Kidney Injury) по диагностике и лечению ОПП, опубликованных в 2012 году, оценку функции почек проводят по уровню креатинина сыворот­ки крови и динамике его нарастания, а также по степени снижения почасовой скорости мочеотде­ления [4].

Основным недостатком такого подхода является невозможность доклинического выявления ОПП. Во многих случаях увеличение концентрации креатинина происходит лишь через 24-48 часов после развития ОПП. Это связано с тем, что почки об­ладают значительным функциональным резервом, поэтому концентрация креатинина не изменяется до тех пор, пока не развивается дисфункции более 50% почечной паренхимы. Кроме того, повышение уровня креатинина в сыворотке крови может зави­сеть не только от функции почек, но и от других факторов, не связанных с мочевыделительной си­стемой [5]. Именно поэтому, в течение последних лет идет активный поиск биологических маркеров, которые обладают большей чувствительностью и специфичностью, чем креатинин, и могут помочь в ранней диагностике ОПП.

Идеальный биомаркер должен продуцировать­ся клетками почек, а его уровень - повышаться непосредственно сразу после и пропорционально степени их повреждения и снижаться вскоре по­сле улучшения функции почек. Данным требова­ниям в основном соответствует липокалин, ассо- циированый с желатиназой нейтрофилов (NGAL, neutrophil gelatinase-associated lipocalin, липокалин-2).

NGAL - белок с молекулярной массой 25 кДа. Первоначально он был выделен из супернатанта активированных нейтрофилов человека, однако позднее было показано, что NGAL может синтези­роваться в разных органах и различными типами клеток (например, гепатоцитами, адипоцитами, клетками почечных канальцев и др.). У здорового человека NGAL в крови определяется в неболь­шой концентрации [6, 7].

Повышение синтеза NGAL в клетках прокси­мальных канальцев связано с ишемией почечной паренхимы или ее поражением нефротоксическими соединениями. При ишемическом поврежде­нии почек выработка NGAL в клетках канальце­вого эпителия многократно увеличивается, воз­растает его концентрация в крови и экскреция с мочой, опережая повышение концентрации креатинина [8]. Содержание NGAL как в моче, так и в сыворотке крови увеличивается пропорционально тяжести и длительности повреждения почек [9].

Достоинством определения NGAL является то, что его уровень можно быстро и просто измерить в небольших объемах биологических жидкостей при помощи средств современного иммунохи- мического, в частности, - иммуноферментного - анализа. Важность раннего выявления таких мар­керов ОПП, как NGAL, не вызывает сомнения, поскольку открывает возможности для своевре­менного лечения ГУС.

Иммуноглобулины (Ig) являются продуктами, образованными системой В-лимфоцитов, и уча­ствуют в специфических гуморальных защитных реакциях организма. Основные функции Ig вклю­чают нейтрализацию и агглютинацию антигена, активацию комплемента и опсонизацию. IgM са­мостоятельно не является опсонином, а только в комплексе с компонентом комплемента С3Ь при­обретает эту функцию. IgM является очень эффек­тивным агглютинином, поскольку имеет пентаме- рическую структуру. У человека определяют че­тыре подкласса IgG: из них IgGl и IgG3 связывают С3Ь, и эти комплексы являются наиболее важны­ми опсонинами. IgG2 и, возможно, IgG4 играют роль агглютининовых антител против микробных полисахаридов. IgA, имеющийся на поверхности слизистой оболочки, состоит из равных коли­честв двух подклассов IgAl и lgA2, образованных плазматическими клетками в слизистой оболоч­ке. Секреторный IgA не является опсонином; он предотвращает прикрепление бактерий к поверх­ности слизистой оболочки, угнетает подвижность бактерий, вызывает их склеивание и нейтрализует эндотоксины и вирусы [10].

Не изучена направленность изменений уров­ней иммуноглобулинов у детей с ГУС, при том, что в большинстве случаев дебют заболевания связан с инфекционным процессом, обусловлен­ным энтерогеморрагическими E.coli или Shigella dysenteriae I типа. Не установлено влияние остро­го почечного повреждения, особенно протекаю­щего с олигоанурией, на их клиренс.

Система комплемента является важным эле­ментов врожденного иммунитета и активирует­ся в результате иммунного ответа организма под действием как антител, относящихся к иммуно­глобулинам классов IgG и IgM, так и бактериаль­ных липосахаридов или других соединений. Ак­тивированные белки системы комплемента либо непосредственно разрушают патоген (киллерное действие), либо обеспечивают лучшее их погло­щение фагоцитами (опсонизирующее действие); либо выполняют функцию хемотаксических фак­торов, привлекая в зону проникновения патогена клетки воспаления [11]. Механизмы активации системы комплемента достаточно хорошо описа­ны при многих заболеваниях, однако недостаточ­но изучены у детей с пост-диарейным ГУС.

Цель работы: определить изменения уровней NGAL, белков системы комплемента С3, С4, им­муноглобулинов крови у детей с ГУС и оценить их диагностическую значимость. Выявить взаи­мосвязи между исследуемыми параметрами и факторами, определяющими тяжесть почечного повреждения и исхода (уровнями лейкоцитов, аланинаминотрансферазы (АлАТ), лактатдеги- дрогеназы (ЛДГ) крови в дебюте заболевания, длительностью анурии и нормализации уровней креатинина и др.).

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Проспективное, продольное исследование про­водилось с 1 января 2013 года по 31 декабря 2015 года на базе Республиканского центра детской нефрологии и почечной заместительной терапии (УЗ «2-я городская детская клиническая больни­ца» г. Минска). Обследовано 159 детей: основную группу составили 35 пациентов в остром периоде ГУС, группу сравнения - 124 человека, перенес­ших ГУС не ранее 6 месяцев после выписки из стационара, группу контроля - 28 здоровых детей. Обследование включало сбор данных анамнеза, анализ медицинской документации, клиническое наблюдение, лабораторные и инструментальные методы исследования.

Для изучения NGAL при диарея- ассоциированном ГУС выделено 4 группы паци­ентов: 1-я - острый период ГУС без потребности в диализе (n=6), медиана возраста 1,92 (1,33-6,67) лет, 2-я - острый период ГУС с необходимостью в диализной терапии (n=20), медиана возраста 2,5 (1-9,42) лет, 3-я - переболевшие ГУС (n=60), медиана возраста 6,4 (1,58-12,67), катамнез забо­левания 4,13 (0,5-8,5) лет; 4-я - 28 практически здоровых детей. Отдельно изучались уровни ли- покалина-2 при атипичном ГУС (аГУС) у мальчи­ка (№1) в возрасте 6,67лет с развитием в остром периоде кровоизлияния в головной мозг и смер­тью, и девочки (№2) 7,42 лет с геморрагическим инсультом при поступлении в диализный центр (ДЦ) и исходом в терминальную почечную недо­статочность. Оба ребенка находились на лечении гемодиализом. Проведен забор образцов сыворо­ток крови в 4 основных точках: 1 точка - посту­пление в ДЦ, 2 точка - восстановление нормаль­ного уровня тромбоцитов, 3 точка - достижение адекватного диуреза (более 1 мл/кг/час) и 4 точ­ка - нормализация уровней креатинина крови. Определение уровней NGAL крови осуществляли методом иммуноферментного анализа с помощью наборов «Human Lipocalin-2 / NGAL (ELISA), R&D Systems» (США).

С целью оценки изменений уровней иммуно­глобулинов и белков системы комплемента С3 и С4 в крови у детей с ГУС выделено 2 группы: в острой фазе ГУС - 35 пациентов с медианой воз­раста 2,33 (1,0-9,42) лет и 124 ребенка, перенес­ших ГУС в анамнезе, в возрасте 6,21 (1,58-16,08) лет, катамнез заболевания 4,34 (0,5-9,17) лет. Ис­следования фракций комплемента C3, С4 и им­муноглобулинов проводились на автоматическом биохимическом анализаторе «Olympus MU 400» («Beckman Coulter», США) методом турбодиме- трии с использованием наборов BioSystems (Ис­пания).

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием программ «Micro­soft Excel 2003» («Microsoft Corporation», США) и «STATISTICA 10.0» («StatSoft Inc.», США). Рас­считывали средние величины и стандартное от­клонение (M±SD) при нормальном распределении признака, медиану и квартили: Me (P25; P75) и Me (Min-Max) - при несимметричном. Для сравнения переменных с нормальным распределением ис­пользовали параметрические методы статистиче­ского анализа, при несимметричном - непараме­трические: хи-квадрат (χ²), χ² с поправкой Йейтса (χ² Йейтса), тест Манна-Уитни. Взаимосвязь пере­менных оценивали по коэффициенту корреляции Спирмена (R_s). Нулевую статистическую гипоте­зу об отсутствии различий и связей отвергали при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При оценке уровней NGAL у пациентов с острым ГУС Д «+» выявлено, что максимальная концентрация его в сыворотке отмечалась при поступлении в стационар и имела тенденцию к снижению в 1-й группе и значимое снижение во 2-й гр. в процессе восстановления функции почек (табл. 1). Отсутствие столь значимого изменения NGAL в группе ГУС без диализа, в сравнении со второй группой, можно объяснить более быстрой нормализацией уровней креатинина крови (в 1-й гр. - 7,2±4,4 дней, а во 2-й 18,2±6,7 дней, р<0,001), при том что на восстановление эпителия прокси­мальных почечных канальцев, как правило, тре­буется больше времени. У всех детей в острой фазе ГУС при поступлении в ДЦ, с потребностью и без в заместительной почечной терапии (ЗПТ), выявлено значимое повышение данного маркера в сравнении с группой после перенесенного ГУС (3-я гр.) и контролем (4-я гр.), что подтверждает наличие ренальных повреждения (табл. 1, рис. 1).

Степень повышения NGAL была существенно выше в группе детей, нуждавшихся в диализе, от­ражая тяжесть повреждения почечных канальцев (табл. 1, рис. 1).

У ребенка с фатальным исходом аГУС (№1) от­мечалось в динамике повышение уровней NGAL, а у ребенка с исходом в терминальную ХПН - эти уровни практически не изменились в процессе те­чения патологического процесса в почках (табл. 1).

При поступлении в ДЦ у 89,5% детей в острой фазе ГУС Д «+» выявлено снижение уровней IgG в сравнении с возрастными нормами и данными группы сравнения (р<0,001) (табл. 2). В процессе восстановления функции почек при ГУС отме­чалось повышение уровней IgG, однако у 47,6% пациентов они сохранялись ниже нормы. Низкие уровни IgA также часто определялись у детей в острой фазе ГУС Д «+» (у 61,3%), частота и уро­вень которых, в отличие от IgG, практически не изменялись к моменту выписки из стационара (табл. 2). Уровни IgM при поступлении в ДЦ хотя и были существенно ниже чем в группе сравнения (р<0,01), но они находились в пределах возраст­ной нормы (табл. 2). В динамике имелось значи­мое их нарастание к концу пребывания в клинике (р<0,01) и у 12% пациентов они превышали нор­мативные значения (табл. 2).

У двоих детей с аГУС уровни иммуноглобули­нов при поступлении в ДЦ не выходили за грани­цы возрастной нормы: у первого пациента IgG - 9,6, IgA - 1,95, IgM - 0,77 г/л, у второго : 9,95, 1,25, 0,7 г/л, соответственно.

На активацию системы комплемента по аль­тернативному пути указывает существенное

снижение уровней C3 (р<0,001) у 76,5% детей в острой фазе ГУС Д «+» при госпитализации в стационар и сохранение С4 в пределах нормы. В динамике заболевания отмечалось нарастание как С3 (р<0,001), так и С4 фракций (р<0,001) (табл. 3). 

По-видимому, активация альтернативного пути комплемента связана с тяжестью повреж­дения почек, о чем свидетельствует снижение С3 фракции комплемента ниже возрастной нормы у 85,7% пациентов с ГУС, нуждавшихся в диа­лизе, по сравнению с теми, кому он был не по­казан - у 28,6% детей (р<0,01) и перенес его ра­нее - у 17,7% (р<0,01). Такая же закономерность выявлялась и при сравнении абсолютных значе­ний С3 (0,73 (0,62; 0,84) г/л по сравнению с 1,07 (0,89; 1,29) и 1,06 (0,95;1,18) г/л, соответственно (р<0,001) (рис. 2).

Выраженное снижение уровней С3 фракции комплемента выявлено у двоих детей с аГУС: 0,56 г/л и 0,69г/л, при нормальных уровнях С4: 0,18 и 0,35 г/л, соответственно.

Нами выявлены тесные корреляционные связи между уровнями NGAL и С3 фракции комплемен­та сыворотки крови при поступлении в ДЦ у де­тей с ГУС Д «+» и показателями, определяющими степень тяжести почечного повреждения (значе­ниями креатинина, длительностью его нормали­зации, потребностью в диализе, продолжительно­стью анурии и диализа), а также другими (табл. 4, рис. 3). В табл. 4 приведены только статистически значимые корреляции (p<0,05).

Обнаружена статистически значимая поло­жительная корреляционная взаимосвязь средней силы между уровнями IgG и IgA (R_s = 0,59), IgM (R_s = 0,54), C3 фракцией комплемента (R_s = 0,67); IgA и IgG (R_s = 0,59), IgM (R_s = 0,62); IgM и IgG (R_s = 0,54), IgM (R_s = 0,62), витамином Д (R_s = 0,47) и отрицательная высокой силы с уровнем фибриногена A (R_s = - 0,7) и средней с интерлей­кином-18 (R_s = - 0,56).

ОБСУЖДЕНИЕ

Маркером раннего повреждения почек явля­ется NGAL, уровень которого существенно по­вышается в сыворотке крови и в моче через часы после развития острого почечного повреждения [9]. H. Trachtman и соавт. впервые изучены из­менения уровней NGAL в моче у детей с ГУС Д «+» в зависимости от тяжести почечного повреж­дения [12]. Авторы отдают предпочтение изме­рению данного маркера в моче, т.к. в сыворотке крови уровень последнего может повышаться при васкулитах [13] и без почечного повреждения. Поскольку ГУС Д «+» не относится к васкулитам, а у большей части пациентов рано развивается ану­рия, нами предпринята попытка оценить уровни и динамику изменений NGAL в крови при данной патологии. При поступлении в ДЦ выявлено по­вышение уровней NGAL у всех детей, как нуждав­шихся в ЗПТ, так и без нее, что отражает развитие ренальных повреждений. Значимое превышение NGAL отмечалось у пациентов с ГУС, которые в последующем получали ЗПТ (р<0,001), отражая тяжесть повреждения проксимальных канальцев почек и определяя дальнейший прогноз (рис. 1). Оценка концентрации NGAL в сыворотке крови и динамики его изменений может служить основой для определения критериев почечного поврежде­ния при ГУС и определения тактики лечения (не­обходимости начала диализной терапии). 

Снижение С3 фракции комплемента и продук­тов его распада (C3b, C3c, C3d) у детей с ГУС Д «+» ранее было описано в литературе [14, 15]. По­вышение уровня продукта распада С3 - фактора В указывало на активацию альтернативного пути комплемента [14]. В последующем это подтверж­дено выявлением высоких уровней фактора Вв и мембраноатакующего комплекса комплемента C5b-9 у детей в острой фазе ГУС Д «+» [16, 17, 18]. Однако не было обнаружено взаимосвязей между степенью активации комплемента и тяже­стью почечных повреждений и исходов ГУС [16, 17]. По результатам нашего исследования сни­жение уровней комплемента С3 при нормальном уровне С4 в крови свидетельствовало об актива­ция комплемента по альтернативному пути у всех пациентов с ГУС Д «+». Кроме того, установлена связь между активацией системы комплемента и тяжестью почечного повреждения: уровни С3 были ниже и встречались чаще у детей, нуждав­шихся в ЗПТ (р<0,001) (рис. 2).

Значения NGAL и С3 фракции комплемента в сыворотке крови у пациентов с ГУС Д «+» отра­жают тяжесть почечного повреждения, что под­тверждается выявлением тесных корреляционных связей между ними и факторами, определяющими это повреждение (уровнями креатинина при по­ступлении в ДЦ, длительностью их нормализа­ции, наличием потребности в диализе, продолжи­тельностью анурии и диализа).

Изменения уровней иммуноглобулинов у больных с ГУС Д «+» впервые описано в работе L. Monnens и соавт., которые обнаружили низкие уровни IgG и высокие IgA, IgM при поступлении в стационар [19]. В нашем исследовании выяв­лены низкие уровни IgG, IgA и нормальные IgM, с последующим нарастанием значений IgG, M и без существенной динамики IgA к моменту вы­писки из ДЦ. Эти изменения указывают на сни­жение гуморального иммунитета при данном за­болевании.

Среднесрочный прогноз при аГУС неблаго­приятный, причем более серьезный у взрослых по сравнению с детьми. Прогноз определяется гено­типом аномалии системы комплемента [20].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты настоящего исследования показа­ли, что определение NGAL в сыворотке крови у пациентов с ГУС позволяет на ранних этапах за­болевания выявлять ОПП. Получены убедитель­ные данные об активации альтернативного пути системы комплемента у детей с ГУС Д «+», а сте­пень снижения С3 фракции, также как и повыше­ние уровней липокалина крови отражают тяжесть почечного повреждения. Снижение IgG и IgA в дебюте заболевания указывают на недостаточ­ность гуморального иммунитета и высокие риски инфекционных осложнений, требующие соответ­ствующей профилактики.