К ВОПРОСУ ОБ ОСОБЕННОСТЯХ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПОКАЛИНА-2 В МОЧЕ

ВВЕДЕНИЕ

Одним из наиболее перспективных биомарке­ров в области лабораторной диагностики острого повреждения почек (ОПП) и прогноза при хрони­ческой болезни почек (ХБП) является липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов (липокалин-2, NGAL). Липокалин-2 - небольшой белок с молекулярной массой 25 кДа, принадле­жащий семейству транспортных белков липокалинов. В сыворотке и моче NGAL может присут­ствовать в трех молекулярных формах - мономера (м.м. 25 кДа), гомодимера (молекулярная масса 45 кДа) и гетеродимера, ковалентно связанного с матриксной металлопротеиназой 9 (молекулярная масса 135 кДа) [1]. В незначительных количествах NGAL присутствует во многих тканях и органах человека: нейтрофилах костного мозга [2], эпите­лии кишечника, трахеи, легких, адипоцитах, гепатоцитах, эпителии канальцев нефрона [3].

Рост концентрации NGAL в моче (uNGAL) явля­ется одним из самых ранних признаков ОПП и про­исходит уже через два часа после ишемического или токсического повреждения почек в связи с массо­вым локальным синтезом NGAL de novo и ухудше­нием его реабсорбции в проксимальных канальцах [4, 5]. Характер изменения концентрации uNGAL не зависит от возраста пациентов, поэтому uNGAL мо­жет быть использован в качестве маркера ОПП как у взрослых, так и у детей [5, 6]. При кардиохирургическом вмешательстве даже при незначительном нарастании концентрации креатинина в сыворотке (<0,044 ммоль/л) повышение уровня uNGAL в пер­вые 48 ч после операции ассоциировано с двукрат­ным увеличением риска смерти пациентов [7, 8]. При контраст-индуцированной нефропатии концен­трация uNGAL значительно возрастает через шесть часов после вмешательства, в то время как концен­трация креатинина достоверно изменяется только через 24-48 ч [9]. У пациентов с раком почки рост uNGAL может рассматриваться как предиктор раз­вития ОПП после нефрэктомии или резекции почки [10]. Помимо этого, доказано, что повышение уров­ня uNGAL ассоциировано с тяжестью деструктив­ных изменений паренхимы почки при ХБП: фибро­пластическими изменениями тубулоинтерстиция, дистрофией и атрофией канальцев [11, 12].

На сегодняшний день диагностическая значи­мость определения uNGAL у пациентов различного клинического профиля очевидна. Хорошо известно, что развитие ОПП при общесоматических заболева­ниях связано с резким ухудшением ближайшего и отдалённого прогнозов за счет снижения выживае­мости, увеличения внутрибольничной летальности пациентов [13, 14]. Тем не менее, в лабораториях не­профильных стационаров определение уровня uN- GAL нецелесообразно, так как данное исследование необходимо ограниченному контингенту пациентов и требует приобретения дорогостоящих тест-систем и оборудования. Измерение концентрации uNGAL проводят методом ИФА («Lipocalin-2/NGAL Human ELISA» BioVendor R&D, Чехия; «NGAL ELISA Kit, Human» ThermoFisher Scientific, США и др.) или иммунохемилюминесцентным методом («Urine NGAL» Abbott Laboratories, США), который явля­ется приоритетным при исследовании по «Cito!». В данной ситуации экономически обоснованной яв­ляется транспортировка биоматериала в специали­зированную лабораторию для централизованного проведения исследования. Данные литературы от­носительно стабильности молекулы NGAL в моче довольно противоречивы. Согласно C.R. Parikh et al. (2014), образцы мочи могут храниться до 24 ч при комнатной температуре [15]. В то же время, M.P. Schuh et al. (2016) не рекомендуют хранение образцов мочи при комнатной температуре, а время хранения при 4 °С не должно превышать 24 ч [16].

Так как некорректное проведение преаналитического этапа является одной из основных причин получения ошибочных результатов лабораторных тестов, целью нашей работы явилось исследова­ние стабильности концентрации NGAL в моче при различных условиях хранения (транспорти­ровки) биоматериала.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор и подготовка биоматериала

Концентрацию NGAL определяли в утренней моче 20 пациентов [средний возраст 41 год (20-59 лет)], госпитализированных в ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Из них у 15 пациентов диагности­рована хроническая болезнь почек (ХБП), у пяти - острое повреждение почек (ОПП). Все пациен­ты давали информированное согласие на участие в исследовании. Взятие биоматериала проводили по стандартной методике, принятой при проведении лабораторных тестов. Образцы утренней мочи до­ставляли в лабораторию в течение 15 мин после по­лучения биоматериала при температуре 0 ... +4 ^oC.

Преаналитический этап работы с образцами включал: аликвотирование, хранение биоматери­ала при различных условиях и центрифугирова­ние. Каждый из 20 образцов мочи аликвотировали по 1 мл в семь одноразовых пластиковых проби­рок и хранили согласно семи протоколам, пред­ставленным в табл. 1 (всего 140 порций).

Центрифугирование образцов проводили не­посредственно перед проведением исследования. Согласно протоколу №1, концентрацию NGAL определяли сразу после доставки образца в лабо­раторию (базовая концентрация). Результаты, по­лученные при исследовании концентрации по ше­сти экспериментальным протоколам, сравнивали с базовым результатом.

Измерение уровня NGAL в моче

Измерение концентрации uNGAL проводили с использованием тест-системы «Urine NGAL», стандартов «Urine NGAL Calibrators» и внутрен­него контроля «Urine NGAL Controls» (Abbott Laboratories, США) на приборе ARCHITECT i2000SR (Abbott Laboratories, США). Тест «Urine NGAL» является хемилюминесцентным двух­ступенчатым иммуноанализом на микрочастицах для количественного определения NGAL в моче человека. На первой стадии смешивают образец, промывочный буфер и парамагнитные микроча­стицы, сенсибилизированные моноклональны­ми антителами против NGAL. Присутствующий в образце NGAL связывается с микрочастица­ми и реакционную смесь промывают. На второй стадии добавляется конъюгат акридин-меченых антител против NGAL. После следующего цикла промывки к реакционной смеси добавляются претриггерный и триггерный растворы, затем автома­тически измеряют уровень хемилюминесценции и рассчитывают концентрацию NGAL в образце. 

Статистический анализ данных.

Оценку силы взаимосвязи между количествен­ными признаками проводили с помощью коэффи­циента корреляции (r) Спирмена. При оценке коэф­фициента вариации (CV) измерение концентрации uNGAL в образце проводили пятикратно. CV оце­нивали отдельно для трех уровней концентраций uNGAL - низкого (11-29 нг/мл), среднего (110-290 нг/мл) и высокого (660-1500 нг/мл). Значения uN­GAL при использовании экспериментальных про­токолов сравнивали с базовыми, сравнение про­водили попарно, при этом использовали формулу стандартного отклонения Дальберга, а также рас­считывали среднее изменение концентрации в про­центах. Нулевую статистическую гипотезу об от­сутствии различий и связей отвергали при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Коэффициенты вариации серий из пяти изме­рений для базового и экспериментальных прото­колов представлены в табл. 2.

Значения коэффициентов вариации не превыша­ют 6,7% для низкого, 4,5% для среднего, 3,3% для высокого уровней и соответствуют характеристикам метода, приведенным в инструкции «Urine NGAL» для систем ARCHITECT i (Abbott Laboratories).

Корреляционный анализ показал, что результа­ты протоколов №2 (4 ч; +22 °C) и №4 (24 ч; +4 °C) в наибольшей степени соответствуют базовым зна­чениям uNGAL (табл. 3). Для результатов исследо­вания по протоколам №5 (48 ч; +4 °C) и №7 (7 сут; -22 °C) коэффициент корреляции с базовыми значе­ниями uNGAL составил 0,99. Наименьшие коэффи­циенты корреляции были получены при хранении образцов в течение 24 ч при +22 °C (протокол №3) и в течение 7 дней при +4 °C (протокол №6).

При хранении образцов в соответствии с про­токолом №3 (24 ч при +22 °C) и протоколом №6 (7 дней при +4 °C) значения uNGAL достоверно отличаются от базового уровня (табл. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании нами были изучены возможности краткосрочного и долгосрочного хра­нения биоматериала для определения концентра­ции NGAL в моче, в наибольшей степени соответ­ствующие возможным условиям транспортировки биообразцов для централизованного исследования, в связи с этим центрифугирование мочи проводили перед измерением концентрации NGAL. 

Актуальность настоящего исследования обу­словлена тем, что данный тест целесообразно проводить в лабораториях специализированных стационаров, оснащенных соответствующими ре­активами и оборудованием. Биоматериал из лечеб­ных учреждений должен быть доставлен в такие лаборатории в соответствующих условиях (тем­пературный коридор и длительность транспорти­ровки) для сохранения концентрации NGAL.

В рутинной лабораторной практике принято про­водить исследование мочи в течение четырех часов после получения при хранении образцов на столе при комнатной температуре либо в течение суток при +2...+8 °C. В настоящем исследовании данным условиям соответствовали протоколы №2 (4 ч; +22 °C) и №4 (24 ч; +4 °C). При использовании данных протоколов концентрации uNGAL в наибольшей степени соответствовали базовым, для них были получены наиболее высокие значения коэффици­ентов корреляции (r₂₄=1,0, p₂₄<0,001), при сравне­нии концентраций попарно значения отличались от базовых в среднем на 4-5%, достоверных различий выявлено не было (p₁₂=0,15; p_1-4=0,35). Наши ре­зультаты совпадают с данными M. P. Schuh и соавт., выполненными в 2016 г. [16]. Авторы статьи также рекомендуют для определения uNGAL краткосроч­ное хранение образцов в течение четырех часов при комнатной температуре и в течение суток при +4 °C. 

Кроме того, нами было показано, что концен­трация uNGAL стабильна в течение двух суток при хранении образцов при +4 °С (протокол №5) и не менее недели при -22 °С (протокол №7). Ре­зультаты измерения липокалина после хранения в соответствии с условиями протоколов изменя­лись в среднем на 3,9-5,2%, имели высокий коэф­фициент корреляции (r₅>0,996, p₅<0,001; r₇=0,999, p₇<0,001) и достоверно не отличались (p₅=0,25, p₇=0,11) при сравнении с базовым протоколом.

В своей работе C.R. Parikh и др. [15] получи­ли данные, свидетельствующие о стабильности концентрации маркеров ОПП в моче, в том числе NGAL, при хранении в течение двух суток как при +4 °C, так и при комнатной температуре (+25 °C). Сделанные авторами выводы основывались на вы­соких коэффициентах корреляции базового и экс­периментального уровней маркера. Как и в рабо­те C.R. Parikh и др. нами были получены высокие коэффициенты корреляции для протоколов №3 (24 ч, +22 °C) и №6 (7 сут, +4 °C) с базовым (r₃=0,810, p₃=0,042; r₆=0,930 p₆=0,001). Несмотря на это, при сравнении концентраций uNGAL эксперименталь­ных и базового протоколов попарно с использова­нием формулы Дальберга значения протокола №3 и №6 достоверно отличались (p₃=0,035, p₆=0,029). При хранении мочи 24 ч при +22 °C концентрация uNGAL в среднем изменялись на 36,2%, а в тече­ние семи суток при +4 °С - на 17,2%. Полученные результаты соответствуют данным M.P. Schuh и др., которые также не рекомендуют определять концентрацию uNGAL в образцах после хранения в течение суток при комнатной температуре [16].

Изменения концентрации uNGAL до 36,2%, вы­явленные в протоколе №3 (24 ч, +22 °C), критичны при оценке прогрессирования ХБП, когда концен­трация данного показателя нарастает умеренно [12]. Следует отметить, что при ОПП концентрация uN- GAL повышается в десятки раз [17], поэтому на на­стоящем этапе исследования сложно судить о том, насколько значимы изменения концентрации на 17,2%, выявленные в протоколе №6 (7 сут, +4 °C), при диагностике ОПП. Тем не менее, при риске раз­вития у пациента ОПП уровень uNGAL необходимо измерять в течение первых суток после повреждаю­щего воздействия для своевременной диагностики и терапии. В связи с вышесказанным при риске ОПП мы рекомендуем доставлять образец в специали­зированные лаборатории в течение четырех часов без охлаждения, при более длительном времени до­ставки необходимо соблюдать холодовой коридор.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, нами показано, что транспор­тировка биоматериала без заморозки возможна на значительные расстояния с сохранением исходно­го уровня uNGAL для централизованного иссле­дования в специализированных лабораториях с соответствующим оснащением, что делает иссле­дование экономически выгодным и упрощает до­ставку образцов.

На основании проведенного исследования, может быть рекомендован следующий протокол преаналитического этапа:

• взятие разовой порции мочи согласно стандартной методике;
• доставка образца в лабораторию:

в течение 4-6 ч при комнатной температуре или +4 °С, не более 48 ч - при +4 °С;

• центрифугирование 1000 g, 10 мин;
• проведение исследования.

Коллектив авторов выражает признательность профессору, д-ру мед. наук Лине Анатольевне Хоров- ской за помощь в математической обработке резуль­татов исследования.