БЕЗОПАСНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ЭМПАГЛИФЛОЗИНА В ОТНОШЕНИИ ПОЧЕК У НОРМОГЛИКЕМИЧЕСКИХ КРЫС С СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ

ВВЕДЕНИЕ

В настоящей работе продолжается описание результатов длительного эксперимента, посвя­щенного изучению влияния конкурентного инги­битора натрий-глюкозного котранспортера прок­симальных канальцев почек (SGLT-2) - эмпаглифлозина (Эмп) на состояние сердечно-сосудистой системы и почек у нормогликемических крыс. Некоторые данные, полученные при выполнении данного исследования, уже были опубликованы ранее [1, 2].

Сахарный диабет (СД) является тяжелым мультисистемным заболеванием, ассоциирующимся с наличием сердечно-сосудистых проявлений и вы­раженными повреждениями почек и мочевыводя­щих путей [3]. В Западной Европе и США при­мерно у 40% всех пациентов, требующих регуляр­ной диализной терапии, причиной терминальной почечной недостаточности (ТПН) является СД [4]. В свою очередь, развитие ТПН определяется наличием при СД экстра- и интраренального ате­росклероза и диабет-ассоциированного повреж­дения клубочков (диабетическая нефропатия - ДН). Кроме того, в почках у больных с СД часто наблюдается выраженное интерстициальное вос­паление [5]. Наконец, пациенты-диабетики со­ставляют группу высокого риска в отношении контраст-индуцированного острого поврежде­ния почек (КИ-ОПП). Они же часто страдают от бактериальных инфекций мочевых путей, иногда приводящих к поражениям почечной ткани как таковой [6].

Мультисистемность СД требует терапевти­ческих подходов и лекарственных препаратов, способных оказывать плейотропные воздействия [7-9]. Например, желательно, чтобы антигипер- гликемические препараты оказывали прямое, кар- дио- и(или) нефропротекторное воздействия [10].

Таким условиям во многом соответствуют кон­курентные ингибиторы мембранного натрий/глю- козного котранспортера - SGLT-2. Имеющиеся данные не оставляют сомнений в том, что инги­биторы SGLT-2 обладают целым рядом позитив­ных плейотропных терапевтических эффектов, в том числе кардио- и нефропротекторным [7-11]. Однако далеко не все вопросы относительно по­следствий их применения (в том числе в плане кардио- и особенно нефропротекции) остают­ся разрешенными. Большинство исследований, подтвердивших нефро- и кардиопротективное действия ингибиторов SGLT-2, выполнены на пациентах с сахарным диабетом или эксперимен­тальных моделях данного заболевания. В такой ситуации нефро- и кардиопротективные эффек­ты данных препаратов могли быть следствием их метаболического (антигипергликемического) дей­ствия. Собственные же кардиальные и ренальные влияния ингибиторов SGLT-2 могут оказаться за­маскированным. Кроме того, не известны многие конкретные механизмы воздействия этих средств на сердечно-сосудистую систему и почки. В силу этих обстоятельств было предпринято настоящее исследование, в котором изучали потенциальные нефро- и кардиопротекторные эффекты ингибито­ра SGLT-2 эмпаглифлозина у крыс линии Wistar с экспериментальной сердечной недостаточностью (СН). В данном сообщении преимущественно описаны последствия сравнительно длительной экспозиции (3 мес) эмпаглифлозина на состояние почек на морфологическом и функциональном уровне.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на взрослых кры­сах- самцах стока Wistar массой 190-210 г (n=21), разделенных с помощью рандомизации на две группы. Хроническую сердечную недостаточ­ность (СН) моделировали путем перманентного лигирования левой коронарной артерии [11]. Пер­вую группу (группа интервенции, СН+Эмп) со­ставили 11 крыс, у которых моделировали ХСН, и через 1 мес после операции начинали лечение эмпаглифлозином («Джардинс®», «Берингер Ингельхайм») внутрь в дозе 1 мг/кг. Вторую группу (группа сравнения, СН) составили 10 крыс с ХСН, не получавших лечения.

Срок наблюдения составил 3 мес. После опе­рации оценивали эффективность модели эхокардиографическим методом, критериями успешно­сти модели ХСН считали наличие участков истон­чения миокарда, нарушений локальной и/или гло­бальной сократимости левого желудочка (ЛЖ).

Животные получали стандартный пищевой рацион (0,34% NaCl). Доступ к воде был свобод­ным. Через 3 мес после начала применения эм- паглифлозина крыс помещали в метаболические клетки для сбора мочи в течение суток. Объем мочи (V) измеряли и с помощью стандартных ла­бораторных анализаторов определялись мочевые концентрации альбумина (UA) и общего белка (UTP), рассчитывали величины суточной экскре­ции (UX24, где Х - концентрация соответствую­щего вещества) этих веществ.

В образцах мочи также устанавливали экспрес­сию микроРНК-2 (миРНК-21) при помощи ре­акции амплификации (RealTime PCR-протокол). Расчет проводили по методу 2^deltaCt.

Для патогистологического исследования фраг­менты почечной паренхимы каждого животного фиксировали незамедлительно после получения образцов ткани в 4% параформальдегиде на фос­фатном буфере, рН 7,4, в течение 24 ч при комнат­ной температуре. После стандартной обработки тканевых фрагментов (обезвоживание и пропит­ка) из парафиновых блоков были приготовлены 4-5 мкм серийные срезы.

Препараты окрашивались реактивом Шиффа (PAS), трихромальной окраской (Masson), гема­токсилином и эозином. Изучение патоморфоло­гических изменений проводилось в светоопти­ческом микроскопе «Carl Zeiss Imager Z2» (Гер­мания). Оценка патогистологических изменений проводилась при обзорной микроскопии. Анализ патоморфологических изменений кортикального и медуллярного слоев оценивался по распростра­ненности того или иного патологического призна­ка [отсутствует, незначительный (до 25%), уме­ренный (<50%), выраженный (>50%)].

Статистический анализ выполнялся с помо­щью пакета прикладных программ STATISTICA 10. Результаты представлялись как медиана [ин- терквартильный размах]. Использован тест Ман­на-Уитни.

Все исследования проведены в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения и со­циального развития РФ от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики» при одобрении этическим комитетом ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский госу­дарственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Назначение эмпаглифлозина эксперименталь­ным животным приводило к закономерно более высоким значениям, как концентрации глюкозы в моче, так и ее суточной экскреции (рис. 1).

В группе интервенции выявлены, также, зна­чимо большие величины суточного объема мочи (рис. 2).

Уровни протеинурии (рис. 3) и альбуминурии (рис. 4) в группах сравнения статистически значи­мо не различались.

Также не было выявлено значимых отличий в уровнях экспрессии миРНК-21 в моче у крыс с СН, получавших и не получавших эмпаглифлозин (рис. 5).

В обеих группах были детектированы схожие патоморфологические изменения. В клубочках на­блюдалось сморщивание тонких базальных мем­бран капилляров клубочков, в которых фокально­сегментарно располагались эритроцитарные ми­кротромбы и круглоклеточные лейкоциты, однако без гломерулита. В капсуле изменений не было, склероза капиллярных петель не наблюдалось.

В мезангии фокально-сегментарно выявлялись признаки экспансии мезангиального матрикса и гиперклеточности. Существенных различий в описанных структурных изменениях между груп­пами не было выявлено.

В тубулоинтерстиции (ТИН) наблюдались признаки исчезновения щеточной каемки эпителия канальцев паренхимы. Распространенными про­явлениями были гиалиново-капельная и вакуо- лярная дистрофии. В сосудистом русле ТИН от­мечалось очаговое полнокровие перитубулярных микрососудов.

Были обнаружены некоторые различия в вы­раженности патологических изменений между группами. Так, более выраженные дистрофиче­ские изменения клеток тубулярного эпителия с деструкцией щеточной каемки, вакуолизацией цитоплазмы и очаговым некробиозом наиболее часто (в соотношении 1:3) выявлялись у крыс с ХСН, не получавших эмпаглифлозин, по срав­нению с группой, получавшей лечение. Причем локализация данных изменений отмечалась в юкстамедуллярной зоне, преимущественно вокруг артериовенозного пучка. Вены при этом были су­щественно дилатированы (рис. 6, 7).

В артериях у животных обеих групп были вы­явлены признаки венозного полнокровия, незна­чительного периартериального отека и склероза. В единичных артериях животных обеих групп от­мечались микротромбы.

Суммарно можно констатировать, что в обеих выборках обнаруживается картина хронического венозного полнокровия. Наряду с проявлениями хронических дисциркуляторных изменений в клу­бочках, периваскулярного склероза и дистрофиче­ских изменений эпителия канальцев в обеих груп­пах, определенные структурные различия все же имели место (см. рис. 6, 7). Выявленные различия, в принципе можно трактовать как несколько менее выраженное повреждение клеток эпителия у крыс с СН+Эмп по сравнению с животными с СН.

ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее мы опубликовали сведения о послед­ствиях месячной экспозиции эмпаглофлозина в плане, прежде всего, почек. Такие последствия выражались в закономерном нарастании концен­трации глюкозы в моче и ее суточной экскреции. Концентрация альбумина в моче у лабораторных животных сравниваемых групп значимо не раз­личалась. Между тем, суточная экскреция этого белка у крыс группы интервенции оказалась зна­чимо большей. Уровень экспрессии миРНК-21 в моче у крыс, получавших эмпаглифлозин, также был выше, чем у животных, не получавших пре­парат [1]. На первом этапе эксперимента мы так­же не зафиксировали увеличения объема мочи на фоне приема ингибитора SGLT-2 [1], тогда как трехмесячный прием эмпаглифлозина вызывал значимый рост диуреза (см. рис. 2). Стоит обра­тить внимание, что медианные значения суточно­го выведения мочи на первом этапе эксперимента в группе интервенции составили: 4,0 [3,20 - 5,60], в группе сравнения - 3,20 [2,80 - 5,0]; на втором этапе эксперимента в группе интервенции: 3,80 [3,60 - 4,30], в группе сравнения - 2,95 [2,80 - 3,10]. Иначе говоря, величины объема мочи в сравниваемых группах на обоих этапах экспери­мента оказывались очень близкими и прослежи­валась тенденция к нарастанию этого показателя на фоне назначения препарата. При этом не до­стижение соответствующего уровня статистиче­ской значимости в первом случае, по-видимому, вызвано очень большим разбросом данных, как в группе интервенции, так и в группе сравнения.

Как при месячном, так и при трехмесячном назначении эмпаглифлозина сохранялся стойкий глюкозурический ответ на препарат (см. рис. 1). Однако в отношении двух других изученных па­раметров - экскреции альбумина и мочевой экс­прессии миРНК-21 данные на двух этапах экс­перимента существенно различались. Как уже указывалось выше, через месяц после примене­ния эмпаглифлозина суточная экскреция (но не концентрация в моче) альбумина у крыс группы интервенции оказалась значимо большей [1]. В то же время, на описываемом этапе эксперимента значимых межгрупповых различий в уровнях как мочевой концентрации, так и суточной экскреции альбумина установлено не было (см. рис. 4). При трехмесячной экспозиции эмпаглифлозина также не было обнаружено значимых различий в отно­шении величин экспрессии миРНК-21 в моче (см. рис. 5), тогда как при месячной этот параметр в группе интервенции имел существенную направ­ленность к росту [1].

Таким образом, полученные данные могут указывать на одну довольно интересную вещь. Возможно, на начальных этапах назначения эмпаглифлозина почки неоднозначно реагируют на прием препарата или на вызванные им изменения тубулярного трафика глюкозы, что и выражается в более высоких уровнях мочевой экскреции аль­бумина или экспрессии миРНК-21 в моче. Однако с течением времени почки адаптируются к воз­можным негативным ренальным эффектам эмпаглифлозина, полностью сохраняя реакцию на его основное глюкозурическое действие. Возможность такой адаптации подтверждается и морфологиче­скими данными, которые можно трактовать как свидетельство несколько менее выраженного по­вреждения клеток эпителия у крыс с СН+Эмп по сравнении с животными с СН (см. рис. 6).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты настоящего исследования в ком­плексе с данными, полученными ранее, показали, что влияние эмпаглифлозина на состояние почек у нормогликемических крыс с сердечной недо­статочностью неоднозначно. На первых этапах экспозиция препарата может вызывать неболь­шую альбуминурию и нарастание относительно­го уровня экспрессии миРНК-21 в моче. Однако с течением времени почки адаптируются к возмож­ным негативным последствиям назначения эмпаглифлозина при сохранении его глюкозурического эффекта. Эти данные, по крайней мере, подтверж­дают безопасность длительного применения дан­ного средства в условиях высокого риска и в от­сутствие нарушений углеводного обмена. Анализ морфологических изменений в почках позволяет надеяться на развитие определенного нефропротективного эффекта. Однако данный вопрос тре­бует дальнейшего уточнения.