СОДЕРЖАНИЕ РЕЦЕПТОРОВ КОЛЛАГЕНА DDR1 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ДЕТЕЙ, БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ПИЕЛОНЕФРИТОМ: СВЯЗЬ С НАРУШЕНИЕМ УРОДИНАМИКИ И МЕТАБОЛИЧЕСКИМИ РАССТРОЙСТВАМИ

ВВЕДЕНИЕ

Ранняя диагностика, профилактика форми­рования и целенаправленная регрессия гломеруло- и/или тубулоинтерстициального фиброза у больных с прогрессирующими хроническими нефропатиями вне зависимости от их этиологии являются лидирующим направлением современ­ной фундаментальной и клинической нефрологии [1-3]. Прогрессирование заболеваний почек явля­ется результатом дисбаланса между про- и антивоспалительными, пролиферативными и фиброзирующими факторами [4].

В этой связи большой интерес представляет исследование рецепторов факторов роста с тирозинкиназной активностью (RTK) и их лигандов. RTK представляют собой трансмембранные ре­цепторы, способные опосредовать многие физио­логические процессы, такие как пролиферация, миграция, дифференцировка и апоптоз клеток. Рецепторы тромбоцитарного (PDGFR), инсулино­подобного (IGFR), эпидермального факторов ро­ста (EGFR), а также фактора роста фибробластов (FGFR) являются представителями этой группы. Обычно связывание лиганда сопровождается димеризацией рецептора, аутофосфорилированием, трансдукцией сигнала и активацией нескольких внутриклеточных путей, включая MAP-киназы (Erkl/2, Jnk, p38, Rrk5) и PI3k/AKT [5].

Одним из активно изучаемых RTK являются рецепторы коллагена - Discoidin domain receptors (DDR1). У людей ген DDRl локализуется на ко­ротком плече 6-й хромосомы в локусе 6p21.3 [6]. Эволюционно DDR-гены, кодирующие DDR, от­ветственны за клеточную адгезию, пролифера­цию и ремоделирование внеклеточного матрикса. DDR1, действующие как рецепторы коллагена, находятся преимущественно в эпителиальных клетках молочной железы, головного мозга, лег­ких, почек и желудочно-кишечного тракта [7, 8]. Известно пять изоформ DDRl (DDRla-e). Из них DDRlb и DDRla представлены в почках. Они ак­тивируются I-VI и VIII типами коллагена [9].

Активация DDRl может происходить локально без дополнительного стимула, когда связывание коллагена в экстрацеллюлярной части рецепто­ра и индукция воспаления в интрацеллюлярной являются самоподдерживающимся процессом, в силу чего образуется порочный круг, приводя­щий к развитию фиброза [10, 11]. Причем при связывании с коллагеном DDRl начинают дей­ствовать как рецепторы факторов роста, которые димеризуются, фосфорилируются тирозинкиназой, что стимулирует реакции р38МАРК [12].

Исследования последних лет были сфокусиро­ваны на том, какова роль DDRl в прогрессирова­нии заболеваний почек и возможно ли при пода­влении его экспрессии добиться снижения темпов прогрессирования основного заболевания. С этой целью изучали различные экспериментальные модели нефропатии. Экспрессию и активацию DDRl при прогрессировании гломерулонефрита наблюдали в модели с введением нефротоксической сыворотки [13]. В модели нефропатии, вы­званной односторонней обструкцией мочеточ­ника, было показано, что трансгенные мыши, лишенные DDRl, защищены от гипертонии, свя­занной с фиброзом почек [14]. К подобному выво­ду также пришли на экспериментальной модели нефропатии, индуцированной введением ангио­тензина II. Патологическое накопление коллагена I и IV типов имело место в почках у животных ди­кого типа и практически несущественно у DDR1-чистых мышей [l5]. Роль DDRl в росте клеток, апоптозе и миграции была рассмотрена на модели почек собак Madin-Darby [l6]. Дополнительные исследования in vitro показали, что DDR1 может быть промежуточным звеном в воспалительном ответе, необходим для созревания и дифференцировки моноцитов и макрофагов и [17]. На осно­вании экспериментальных исследований было сделано заключение, что аномальная экспрессия рецептора DDRl является ключевым фактором прогрессирования заболеваний почек, способ­ствуя воспалению и фиброзу.

Кроме того, были выполнены ряд эксперимен­тальных работ, в которых экспрессия DDRl была подавлена ингибиторами RTK с преимуществен­ной селективностью для DDRl. При этом отме­чалось замедление развития нефросклероза, что открывает новые перспективы для лечения забо­леваний, связанных с воспалением и фиброзом [l8-22].

Данные факты подтверждают гипотезу о том, что таргетинг DDR1 может быть перспективным направлением в лечении различных нефропатий вне зависимости от их этиологического фактора, однако определение его роли в патогенезе заболе­ваний почек у человека нуждается в дополнитель­ных исследованиях.

В доступной литературе мы не нашли работ, устанавливающих участие DDR1 в патогенезе хронической патологии почек, тем более ХП у де­тей, взаимоотношение с другими факторами, вли­яющими на течение заболевания и его прогноз. Цель исследования: определить уровень рецеп­торов коллагена DDR1 в сыворотке крови детей, больных ХП в зависимости от его форм.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Проведено обследование 306 больных с ХП в стадии клинико-лабораторной ремиссии в воз­расте от 6 до 16 года. Средний возраст пациентов составил 11,3±3,2 лет, большинство пациентов - девочки (249 человек). В структуре ХП выявлено преобладание детей с вторичным ХП (ВХП) - 246 человек (80,39%). Среди них вторичный обструк- тивный ХП (ВОХП) - у 183 (74,39%), вторичный дисметаболический ХП (ВДХП) - у 63 (25,61%). С первичным ХП обследовано 60 (19,61%) детей. Диагноз пиелонефрита устанавливали в соответ­ствии с рекомендациями М.Я. Студеникина и со- авт., (1980).

Из 183 у 47 (19,11%) пациентов с ВОХП в анамнезе имелись признаки ПМР. Гидронеф­ротическая трансформация была выявлена у 51 ребенка (20,73%). Аномалии числа почек диа­гностированы у 33 (13,41%) больных, аномалии расположения почек - у 13 пациентов (5,28%). Нефроптоз выявлен у 18 (7,32%) детей, нейро­генная дисфункция мочевого пузыря (НДМП) - у 24 (9,75%).

В структуре ВДХП из 63 у 39 (61,90%) де­тей диагностирована оксалатно-кальциевая кристаллурия. Уратная нефропатия выявлена у 12 (19,05%) детей. Нефропатия с повышенной су­точной экскрецией фосфатов встречалась у 7 (11,11%) обследованных, смешанная кристаллу- рия - у 5 (7,94%).

Среди 107 (34,96%) детей, имеющих отяго­щенную наследственность по заболеваниям мо­чевой системы, преобладал удельный вес боль­ных с ВОХП, составивший 76,64% - 82 ребенка, ВДХП - 23,36% (25 детей).

Контрольную группу (КГ) составили 30 здоро­вых детей аналогичного возраста.

Исследования проведены в соответствии с эти­ческими принципами, принятыми Хельсинкской Декларацией и Качественной Клинической Прак­тикой (GCP). От родителей и детей старше 12 лет было получено письменное информированное согласие. Протокол исследования одобрен этиче­ским комитетом Крымского государственного ме­дицинского университета им. С.И. Георгиевского (протокол № 1 от 28.08.2012 г.).

Комплекс лабораторных исследований, по­мимо традиционно принятого в нефроурологической практике, включал определение в сыво­ротке крови Human Discoidin Domain Receptors (DDR1) с помощью стандартного набора («TSZ Eliza», USA). Исследования проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа. В исследовании использовали полуавтоматический анализатор «Stat Fax 2100» производства USA. Функциональное состояние почек оценивали пу­тем определения скорости клубочковой фильтра­ции (СКФ) по формуле Schwartz.

Констатацию обструктивной уропатии про­изводили на основании стандартного рентген- урологического обследования (экскреторной урографии, микционной цистоуретерографии) и уль­тразвукового исследования.

Статистический анализ результатов проведен с использованием стандартного пакета приклад­ных программ «Statistica v. 6.0» («StatSoft Inc.», USA). Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. В случае распределения, отличающегося от нормального, центральные тенденции представлены в виде ме­дианы (Ме) и межквартильного интервала [25-й (Low quartile - Lq) и 75-й (Upper quartile - Uq)]. При сравнении двух независимых признаков ис­пользовался критерий Манна-Уитни. Оценку статистической связи (корреляции) между от­дельными показателями проводили с помощью коэффициентов ранговой корреляции Спирмена. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Изучение содержания рецепторов DDR1 сыво­ротки крови в общей группе у 306 больных с ХП позволило выявить их статистически значимое превышение условной нормы (р=0,020), что со­ставило 85,8 (71,8; 97,5) пг/мл (рис. 1).

Проведенный анализ DDR1 в зависимости от формы ХП показал, что значение DDR1 у паци­ентов с ВХП, составивших абсолютное большин­ство (80,39%), было идентично в общей группе и составило 87,70 (73,80; 99,11) пг/мл, р=0,008 в сравнении с КГ.

В отличие от значения DDRl при ВХП у боль­ных с ПХП уровень DDRl сыворотки крови не имел отличий от референсных значений [77,7 (66,1; 91,1) пг/мл, р=0,464] и был статистически достоверно ниже (р=0,006) соответствующего по­казателя при ВХП (рис. 2).

Проведенный анализ значения DDR1 в сыво­ротке крови больных ВХП в зависимости от на­личия обструктивных уропатий или дисметаболических расстройств, лежащих в подоплеке разви­тия и прогрессирования ВХП у детей с ВДХП, не выявил отклонений уровня DDR1 от показателей КГ (р=0,549), что составило 79,9 (61,5; 91,6) пг/ мл. Напротив, больные с ВОХП показали значи­мо более высокую (р=0,001) концентрацию DDR1 сыворотки крови - 88,8 (76,7; 99,5) пг/мл со ста­тистически значимым отличием между обеими формами ВХП (р=0,002) (рис. 3).

Детальный анализ значения DDR1 у пациен­тов, страдающих ВОХП, позволил констатировать наиболее высокие концентрации у больных, име­ющих в анамнезе ПМР, - 100,4 (89,3; 109,9) пг/ мл, что значительно превышало не только референсные значения, но и уровень DDR1 у больных с ВОХП на фоне других обструктивных уропатий (кроме ПМР), (р<0,001) (рис. 4).

Именно у пациентов, где развитие и прогрес­сирование ХП было связано с ПМР, получены значительно превышающие норму показатели и других маркеров, косвенно свидетельствующих об активности провоспалительных и профиброгенных процессов в тубулоинтерстиции, что по­казано в таблице.

Умеренной силы положительные корреляцион­ные связи объединяли показатель DDR1 с уровня­ми TGF-P₁ - Rs =0,52; p<0,038; IL-17 - Rs =0,4665; p<0,0184 и IL-12 - Rs =0,351; p<0,022 в сыворотке крови, значения которых многократно превышали условную норму (р<0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ

Все пациенты в соответствии с критериями включения детей в исследование находились в состоянии клинико-лабораторной ремиссии ХП сроком не менее 3 мес, имели нормальные анализы мочи, отсутствие диагностически зна­чимой бактериурии. СКФ по формуле Schwartz соответствовала I стадии ХБП. Однако, не­смотря на отсутствие явных, в традиционном понимании, признаков активности микробно­воспалительного процесса, было выявлено зна­чимое повышение уровней рецепторов коллаге­на DDR1 сыворотки крови у больных ВХП, кос­венно свидетельствующее о торпидном течении латентного воспалительного процесса с актив­ным фиброгенезом. Причиной которого, помимо бактериального воздействия, является травми­рующее влияние на паренхиму почек уродинамического (механического, динамического), дисметаболического и других факторов. А у детей с врожденными аномалиями развития почек и мочевыводящих путей ХП изначально протекает на фоне уже имеющей место иммунологической перестройки в силу дезорганизации дифференцировки их тканей [23, 24].

Обструкция мочевыводящих путей - один из наиболее весомых факторов, приводящих к уростазу, нарушениям гемодинамики и ишемии по­чечной ткани, что является причиной поврежде­ния клеток канальцев и интерстиция при обструктивном варианте ВХП [1, 25].

При дисметаболическом ВХП поражения по­чек вызывают различные продукты нарушенно­го обмена веществ вследствие их накопления в паренхиме почек, а нестабильность мембранных структур определяет нарушения функционирова­ния тубулярных эпителиоцитов, расположенных в отделах наивысшей ионной концентрации интер­стициальной ткани почек [26, 27].

Вероятно, различие неспецифических этио­логических факторов при дисметаболическом и обструктивном вариантах ВХП приводит к не­равноценной экспрессии рецепторов DDR1, яв­ляющихся важным звеном в процессе синтеза коллагена - нормальной при ВДХП и значительно превышающей норму при ВОХП. Данный факт является свидетельством риска развития тубуло- интерстициального фиброза у больных с ВХП, протекающим на фоне обструктивных уропатий, с большей вероятностью, чем у пациентов с те­чением ВХП на фоне дисметаболических нефро­патий.

Среди пациентов, страдающих ВОХП, 47 (19,11%) имели в анамнезе ПМР. Несмотря на то, что всем детям не позднее, чем за 1 год до прово­димого обследования, было проведено его хирур­гическое лечение, данная категория детей имела значительно более глубокие иммунные сдвиги по сравнению с показателями больных ХП на фоне других обструктивных уропатий. Этиологически определяющими факторами при ВХП на фоне ПМР, помимо бактериального, являются повы­шение внутрилоханочного и внутриуретерального давления, отрицательная гидродинамика и, как следствие, развитие внутрипочечных рефлюксов [28, 29]. В ответ на повреждение клетки экспрессируют рецепторы DDR1, что способ­ствует интенсификации адгезии, миграции, дифференцировке и созреванию лейкоцитов, продук­ции ими цитокинов, приводит к индукции воспа­лительного ответа и профиброгенных эффектов. Подтверждением данного тезиса являются полу­ченные при ВОХП на фоне ПМР прямые корре­ляционные связи между DDR1 и TGF-β₁, IL-17, IL-12 - ключевыми провоспалительными, профиброгенными и проапоптоидными цитокинами сыворотки крови. Текущий воспалительный про­цесс индуцирует выработку коллагена с повтор­ной активацией DDR1 и последующим прогрес­сированием воспаления по механизму обратной положительной связи, что дает основание пред­положить у пациентов с ПМР наличие самоподдерживающегося, возможно асептического, вос­палительного процесса, связанного с накоплени­ем экстрацеллюлярного матрикса. Это дает по­вод предусмотреть у пациентов с ХП, имеющих в анамнезе ПМР, сохраняющийся риск развития рефлюкс-нефропатии [30], однако данный тезис нуждается в дальнейшем исследовании.

У больных с ПХП в стадии клинико­лабораторной ремиссии констатированы допусти­мые значения DDR1 сыворотки крови, что сви­детельствовало о низком риске фиброзирования тубулоинтерстиция при ХП без сопутствующих нарушений уродинамики.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, рецепторы с тирозиназной ак­тивностью DDR1, активированные коллагеном, являются одновременно медиаторами при про­лиферации, фиброзе и воспалении. Их изучение является перспективным направлением, нацелен­ным на доклиническую диагностику структурных изменений тубулоинтерстиция, связанных с ла­тентным воспалительным процессом и, как след­ствие, его склерозированием.

Исследование DDR1 в сыворотке крови боль­ных ХП выявило их статистически значимое пре­вышение условной нормы у пациентов с ВХП, протекающим на фоне обструктивных уропатий, несмотря на ранее диагностированное состояние клинико-лабораторной ремиссии. Это дает осно­вание отнести данную категорию пациентов к группе высокого риска развития осложнений ХП, связанных с структурной перестройкой тубулоинтерстиция и снижением почечных функций, а у больных ХП, имеющих в анамнезе ПМР, форми­рования рефлюкс-нефропатии.