ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ СЫВОРОТКИ КРОВИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ ПОЧЕК У ДЕТЕЙ

ВВЕДЕНИЕ

Начало XXI века во всем мире ознаменовано ростом распространенности хронической болезни почек (ХБП) уже в детском возрасте, снижением качества жизни и социальной активности пациен­тов [1-6]. Морфологической основой дисфункции почек при ХБП является нефросклероз [7]. Дет­ский возраст представляет собой уникальный пе­риод жизни человека, когда нефропротективные мероприятия наиболее эффективны. Поэтому по­иск биомаркеров повреждения почечной ткани, как прогностически значимых факторов развития нефросклероза, имеет особое значение в педиа­трии [7-11].

Участие цитокинов в патогенезе различных заболеваний почек подтверждено результатами ряда исследований последних лет [12-17]. Пока­зано, что цитокины могут синтезироваться эпите- лиоцитами проксимальных канальцев, оказывая в дальнейшем пара- или аутокринное влияние на клетки-мишени, стимулируя процессы клеточ­ной пролиферации, дифференцировки, роста и секреции [18, 19]. Несмотря на локальный харак­тер действия, некоторые из них обнаруживаются в системном кровотоке и биологических жидко­стях, что может иметь диагностическое значение при заболеваниях почек [20, 21]. Однако большая часть исследований в настоящее время посвяще­ны цитокинам при отдельных группах или нозо­логических формах болезней почек без акцента на стадию ХБП и без сравнения изучаемых показа­телей в зависимости от первичного заболевания [12-17].

Цель исследования - изучение диагностиче­ской и прогностической значимости определе­ния показателей цитокинового статуса сыворотки крови у детей с различными нозологическими формами заболеваний почек.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Под наблюдением находились 255 детей с раз­личными заболеваниями почек. Контрольную группу составили 50 практически здоровых де­тей. Больные были распределены на 3 группы: 1-я группа - 16 детей с мочекаменной болез­нью (МКБ) и дисметаболической нефропатией (ДМН) без инфекции, 2-я группа - 174 ребенка с микробно-воспалительными заболеваниями почек (МВЗП), 3-я группа - 65 детей с гломерулопатиями (ГН). Среди детей с МВЗП было 165 наблюдений с острым и хроническим пиело­нефритом и 9 - с циститом. Развитие микробно­воспалительного процесса в мочевой системе было обусловлено следующими факторами: ВПР МВС - 40, из них пузырно-мочеточниковый реф- люкс - 11, гидронефроз - 10, удвоение почек - 9, кисты почек - 3, гипоплазия почки - 3, стеноз пиелоуретрального сегмента - 2, тазовая дисто­пия - 2; ДМН - 80; нейрогенный мочевой пузырь (НМП) - 26 детей. При ХБП в зависимости от ста­дии выявлена различная патология. При 1 ст. - это ДМН и НДМП (средний возраст детей 9,1 года), при 2 ст. - ВПР МВС (представленные выше) и ДМН (средний возраст детей 6,8 года). Причем, у больных с ХБП 2 ст. в 70% случаев отмечалось сочетание нескольких факторов. При 3 ст. - ПМР, рефлюкс-нефропатия (мальчик 16 лет и девоч­ка 13 лет), при 4 ст. - гидронефроз обеих почек (мальчик 1 год), при 5 ст. - кистозная дисплазия обеих почек (мальчик 15 лет),

Длительность болезни во всех группах наблю­даемых больных была больше 3 мес. У каждого ребенка определена стадия ХБП согласно клас­сификации National Kidney Foundation-K/DOQI (2003) в соответствии с уровнем СКФ, рассчитан­ной по формуле Шварца (2009) [22, 23] (табл.1).

Преобладали дети с 1-й и 2-й стадией ХБП. Поэтому показатели цитокинового профиля детей с ХБП С3-5 стадией (ХПН) использовали только для оценки воспалительного индекса (ВИ), кото­рый рассчитывали как соотношение про- и проти­вовоспалительных цитокинов [13, 14].

Средний возраст обследованных детей: 1-я группа - 10,7 ±2,7 года, 2-я группа - 8,7 ± 0,7 года, 3-я группа - 9,1 ± 1,1 года, p>0,1. По половому со­ставу в 1-й и 3-й группах преобладали мальчики (87,5 и 60% соответственно), а во 2-й - девочки (83,3%).

Всем обследуемым было выполнено количе­ственное определение в сыворотке крови следу­ющих цитокинов: TNF-α (tumor necrosis factor a, фактор некроза опухоли альфа), TNFRI и TNFRII (tumor necrosis factor I and II receptor, рецепто­ры I и II к фактору некроза опухоли), IL-10 (in­terleukin-10, интерлейкин-10), TGFβ₁ и TGFβ₃ (transforming growth factor-β, трансформирую­щий фактор роста-β 1-го и 3-го типов), IL-2 (in­terleukin-2, интерлейкин-2), IL-2-SR (interleu­kin-2 solublereceptor, растворимый рецептор к интерлейкину-2). Забор крови осуществляли у каждого ребенка в утреннее время натощак, да­лее образцы крови хранили при -76 °С. Иссле­дование проводили методом сэндвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа, с использованием специфических реактивов фир­мы «R&DDiagnostics Inc» (США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Учет результатов производили с помощью иммуноферментного анализатора «Multiscan» (Финляндия). Расчеты количества показателей осуществляли путем построения калибровочной кривой с помо­щью компьютерной программы, выражали в пг/ мл или нг/мл. Образцы крови исследовали в ли­цензированной лаборатории химии неинфекцион­ного иммунитета Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Еляко- ва» Дальневосточного отделения Российской ака­демии наук (руководитель отдела, д-р хим. наук проф. П.А. Лукьянов).

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием пакета приклад­ных программ «Statistica 10» («StatSoft», США), «Microsoft Excel 10». Для оценки показателей цитокинов применяли непараметрическую статисти­ку и анализ качественных данных («U-критерий Манна-Уитни», р - значение двустороннее, рас­чет значения критерия корреляции R, медианы и квартилей). Для оценки цитокинового профиля крови у детей 3-й группы (МВЗП) использовали параметрическую статистику: средние величины признаков (М), ошибки средних величин (± mx), для оценки статистической значимости получен­ных результатов в расчетах применяли t-критерий Стьюдента. Для определения клинической значи­мости показателя TNF-α применялся ROC-анализ (Receiver Operator Characteristic) - метод линей­ной регрессии с построением ROC-кривых, ко­торый позволяет оценить качество модели (диа­гностического признака - его чувствительности и специфичности), с использованием программы Med Calc. При этом учитывался показатель AUC (Area Under Curve). О качестве теста судили по экспертной шкале для значений AUC. Нулевую статистическую гипотезу об отсутствии различий и связей отвергали при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Фактор некроза опухоли альфа (ФНО-альфа, TNF-α) - это провоспалительный цитокин, синте­зирующийся в основном моноцитами и макрофа­гами [20, 21]. В нашем исследовании у всех боль­ных с заболеваниями почек уровень TNF-a в крови выше, чем у здоровых детей, причем достоверно выше у детей с МВЗП и ГН (табл. 2). Интересен тот факт, что у всех больных с заболеваниями по­чек уровень TNF-a в моче также достоверно выше (собственные исследования), чем у здоровых де­тей, наиболее высокий его показатель был обна­ружен в группе больных с гломерулонефритами [24], что совпадает с данными других исследова­телей [14, 25-27]. И.И. Жизневская и соавт. (2014) показали, что дебют гломерулопатий независимо от дальнейшего их течения характеризовался вы­соким уровнем ФНО-альфа, что свидетельствует о выраженности воспалительного иммунопатоло­гического процесса в почках при изучаемой пато­логии [14].

При выполнении бинарного логистическо­го регрессионного анализа и построении ROC- кривой для показателя TNF-a определялось рас­положение кривой в левом верхнем углу как у детей с МВЗП, так и у детей с ГН. Интервал AUC под кривой для данных групп наблюдения был практически одинаковым (0,8). Это доказывает, что качество модели (по экспертной шкале) очень хорошее.

Известно, что множественные активности TNF реализируются через два типа рецепторов - тип 1 и тип 2 [20].Растворимые рецепторы связывают и нейтрализуют TNF-α. Показатель TNFRte крови у всех больных выше, чем у здоровых детей, но до­стоверных различий между всеми группами детей не обнаружено, причем наиболее высокий TNFRfy детей с гломерулонефритами в 1,3 раза по сравне­нию с контрольной группой. TNFRII в крови у всех наблюдаемых больных детей (группы 2-4) ниже, чем у здоровых. Самый низкий показатель TNFRII в крови обнаружен в группе детей с МВЗП, что ста­тистически значимо (р<0,05) (табл. 2).

При анализе содержания TNF-α в крови у де­тей с острым (п=35) и хроническим пиелонефри­том (п=80) (ПН) в динамике заболевания выявле­но достоверное его повышение при остром пиело­нефрите по сравнению с показателями контроль­ной группой (п=22) (21,87 ± 5,23 и 4,28 ± 0,67 пг/мл соответственно; р ≤ 0,005). Установлено достоверное увеличение TNF-α и у детей с хро­ническим пиелонефритом при обострении болез­ни (п=43), частичной (п=10) и полной клинико­лабораторной ремиссии (п=27) по сравнению с контрольной группой (26,25 ± 4,77; 19,44 ± 3,51; 17,52 ± 3,47 пг/мл соответственно р ≤ 0,001) (рис. 1). В исследованиях О.Г. Быковой (2013, 2014) также статистически доказано повышение TNF-α в крови у детей на всех стадиях хрониче­ского пиелонефрита [16, 29].

При анализе показателей растворимого рецеп­тора II фактора некроза опухоли-α выявлено зна­чительное достоверное снижение растворимого рецептора II фактора некроза опухоли-α в крови у больных с острым пиелонефритом (1381,81 ± 167,79 пг/мл; р≤ 0,002) по сравнению с показате­лем контрольной группы (2897,94 пг/мл) (рис. 2).

При хроническом пиелонефрите также опре­делено достоверное снижение уровня sTNFRII в крови у больных на всех стадиях, при этом более значимое его снижение отмечено в активной ста­дии (1766,37 ± 118,11 пг/мл; р≤ 0,02). В стадии частичной клинико-лабораторной ремиссии пока­затель sTNFRII равен 1813,83 ± 155,49 пг/мл (р< 0,05) и полной клинико-лабораторной ремиссии - 1993,24 ± 159,46 пг/мл (р <0,05) по сравнению с показателем контрольной группы (2897,94 пг/мл) (рис. 2).

Интерлейкин-2 (IL-2) - растворимый глико­протеид, являющийся провоспалительным цитокином, медиатором иммунитета и воспаления. Он продуцируется Т-клетками в ответ на антигенную и митогенную стимуляцию [20].В нашем исследо­вании IL-2 в крови у больных с МВЗП достовер­но ниже по сравнению с группой здоровых детей (р<0,001). Однако уровень рецептора IL-2 R выше у всех детей с заболеваниями почек по сравнению с показателями контрольной группы (табл. 3). В исследованиях, проводимых нами ранее, показа­тель IL-2 в моче у всех больных достоверно ниже по сравнению с группой здоровых детей (р<0,05). Самый низкий показатель оказался у детей с об­менными нарушениями. Однако уровень рецепто­ра IL-2 R в моче достоверно выше у детей с МВЗП и детей с ГН по сравнению с группой здоровых детей. Самый высокий статистически значимый показатель зарегистрирован у детей с МВЗП, что вполне закономерно (р<0,05) [24].

IL-10 относится к группе противовоспалитель­ных цитокинов [20]. В нашем исследовании пока­затель IL-10 в крови у больных детей всех групп оказался достоверно меньше, чем в контрольной группе (табл. 4). Самый достоверно значимый низкий показатель IL-10 в крови обнаружен в группе детей с МВЗП (р<0,001). Полученные дан­ные совпадают с данными других исследователей [12, 15].

В крови нами исследованы противовоспали­тельные цитокины: TGF-β₁ и TGF-β₃. Выявлено, что уровень цитокина TGFβ₁ у пациентов 4-й группы достоверно (и закономерно) выше, чем у детей контрольной группы (р<0,05). Интерес­но, что уровень цитокина TGFβ₃ у детей с обменными заболеваниями оказался также выше, чем у здоровых детей. У детей с МВЗП и ГН показательTGF-β₃ в крови оказался достоверно ниже по сравнению с детьми контрольной группы (см. табл. 4).

Известно, что при определении биомаркеров воспаления необходимо исследовать не только уровень цитокинов, но и их соотношений, что позволяет оценить относительный дефицит или гиперпродукцию изучаемых медиаторов [15]. В нашем исследовании мы использовали показатель цитокинового воспалительного индекса (ВИ), который рассчитывали как соотношение про- и противовоспалительных цитокинов. Итак, при оценке ВИ Т№-а/ИЛ-10 определен достоверно высокий его уровень у всех пациентов, особенно у детей с МВЗП (3-я группа наблюдения) индекс наиболее высокий (1,41±0,19, n=50), чем у здоро­вых детей (0,13±0,02, n=50), р<0,001 (табл. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ

Фактор некроза опухолей (TNF-α) относит­ся к провоспалительным цитокинам, роль его в прогрессировании ХБП исследована достаточно широко. Известно, что персистентное увеличение TNF ассоциируется с развитием недостаточности многих органов и летальностью, вызывая гипо­тензию, тахипноэ, диарею, гематурию, тромбопо- эз, метаболический ацидоз, а также многочислен­ные повреждения тканей, обычно наблюдаемые при остром воспалении. Кроме того, он характе­ризуется как фактор, вызывающий атрофию [20]. Однако же TNFRII ограничивает воспаление. В нашем исследовании повышение активности TNF-α сопровождается снижением растворимого TNF-RII в сыворотке крови, что свидетельствует о сохранении активности воспалительного про­цесса, особенно при обострении хронического пиелонефрита. sTNF-RII может быть использован в качестве дополнительного маркера воспаления почечной ткани. Выявлена положительная кор­реляционная связь между TNF-α и TNF-α RI (R = 0,58) у больных с ГН. TNF-α RI в этой группе наиболее высокий. Кроме того, в группах детей с МВЗП и ГН (3-я и 4-я группы наблюдения) по­казатель AUC составил 0,8. Это доказывает, что качество модели (по экспертной шкале) очень хо­рошее (по терминологии метода) и позволяет ре­комендовать использование данного показателя в сыворотке крови в качестве дополнительного диа­гностического критерия развития воспаления (как специфичного и чувствительного маркера острого пиелонефрита и его хронизации). Одновременно, учитывая, что расположение ROC кривой TNF-α определялось в левом верхнем углу как у детей с МВЗП, так и у детей с ГН и интервал AUC для данных групп наблюдения был одинаковым (0,8), можно говорить о TNF-α как критерии иммунного воспаления почек.

Основной биологический эффект IL-2, благо­даря которому он получил название ростового фактора лимфоцитов, заключается в стимуля­ции пролиферации различных клеточных ти­пов [20]. IL-2 стимулирует клеточное деление как Т-лимфоцитов хелперов, синтезирующих его в ответ на антигенную стимуляцию, так и Т-лимфоцитов киллеров, действующих по ауто- кринному и паракринному типу. Кроме того, IL-2 в В-лимфоцитах стимулирует выработку антител, в моноцитах - продукцию провоспалительных цитокинов, фагоцитоз и бактерицидность [20, 21]. В ряде работ выявлено, что в лимфоцитах больных с идиопатическим нефротическим син­дромом отмечаются высокие концентрации ИЛ-2, при этом уровень ИЛ-2 повышен при обострении и остаётся нормальным в ремиссии [14, 28]. До­казано, что в реализации поражения почек при хронической герпес-вирусной инфекции имеет значение нарушение клеточного иммунного от­вета вследствие измененной функции инфициро­ванных вирусом В-лимфоцитов и моноцитов. Так у детей с герпетической инфекцией и мембраноз­ной нефропатией выявлена резко сниженная про­дукция IL-2 [29]. В нашем исследовании IL-2 кро­ви у больных с МВЗП достоверно ниже по сравне­нию с группой здоровых детей (р<0,001). Однако уровень его рецептора IL-2 R выше у всех детей с заболеваниями почек, но достоверных различий обнаружено не было. Нами выявлена положитель­ная корреляция между TNF-α и IL-2 R (R = 0,51) в крови у детей с ГН. Таким образом, воспалитель­ные и аутоиммунные реакции у дефицитных по IL-2 больных детей можно объяснить снижением клеточного иммунитета, развитием лимфопролиферации и аутоиммунных расстройств. Повы­шение уровня IL-2 R можно отнести к маркерам воспаления [20].

Установлено, что показатель IL-10 в крови у здоровых детей достоверно выше, чем у наблюда­емых больных с заболеваниями почек. В исследо­вании, проводимом нами ранее, показатель IL-10 в моче у больных детей всех групп также оказался меньше, чем у здоровых детей. Самый достовер­но значимый низкий показатель IL-10 в моче об­наружен в группе детей с МВЗП (р<0,05), что за­кономерно, учитывая патогенез этих заболеваний [24]. Это объяснимо с учетом известных данных о свойствах данного цитокина: IL-10 - противо­воспалительный цитокин, супрессирующий про­дукцию провоспалительных цитокинов и являю­щийся существенным ингибитором клеточного иммунитета [20, 21]. Нами выявлена положитель­ная корреляционная связь между IL-10 и IL-2 (R = 0,91) в крови у детей с МВЗП, что доказывает роль дефицита цитокинов ИЛ-10 и IL-2 в сниже­нии клеточного иммунного ответа у больных с за­болеваниями почек.

TGF-β - противовоспалительный цитокин, бе­лок, контролирующий пролиферацию, клеточную дифференцировку и другие функции большинства клеток. Семейство трансформирующих ростовых факторов (TGF) у человека включает 3 основных: TGF-β₁, TGF-β₂, TGF-β₃[20]. Цитокины семейства TGF имеют различное биологическое действие: изменение пролиферации клеток, в большинстве случаев - подавление; усиление формирования внеклеточного матрикса за счет активации син­теза его компонентов и подавления деградации; иммуносупрессивное действие [20]. При разви­тии патологии TGFβ₁ является основным медиа­тором формирования фиброза и вероятно в группе больных с ГН, где он достоверно выше в крови, чем у здоровых детей (р<0,05), этот цитокин мож­но рассматривать как ранний маркер развития нефросклероза. Показатель TGF-β₃ достоверно снижен у детей с микробно-воспалительными за­болеваниями почек и у детей с ГН по сравнению со здоровыми (р<0,05). Это объяснимо с учетом известных данных о его свойствах: TGF-β₃ - про­тивовоспалительный цитокин, супрессирующий продукцию провоспалительных цитокинов и яв­ляющийся существенным ингибитором клеточно­го иммунитета [20, 21]. Нами выявлена сильная положительная корреляционная связь между IL- 10 и TGF-β₃ (R = 0,88) в крови у детей с МВЗП. В собственных исследованиях, проводимых нами ранее, выявлено, что уровень цитокина TGFβ₁ в моче у пациентов 3-й и 4-й групп достоверно (и закономерно) выше, чем у детей контрольной группы (U221/0,035, р<0,05 и 169/0,033, р<0,05 соответственно) [24]. Интересно, что уровень цитокина TGFβ₃ в моче у детей с обменными за­болеваниями оказался достоверно выше, чем у здоровых детей, что требует дальнейшего иссле­дования и обсуждения [25].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Повышение показателя TNF-α в сыворотке крови рекомендуется рассматривать как специ­фичный маркер имунного воспаления, а также острого пиелонефрита и перехода его в хрониче­скую стадию, т.е. TNF-α можно считать универ­сальным цитокином, участвующим в различных патогенетических процессах при заболеваниях почек у детей. Снижение TNF-RII можно отнести к маркеру полной клинико-лабораторной ремис­сии пиелонефрита. Повышение TNF-α-ΚΙ возмож­но рассматривать в качестве маркера аутоимунно- го воспаления. Дефицит IL-2, ИЛ-10 и TGFβ₃ при повышении IL-2 R в крови необходимо использо­вать как маркер бактериально-воспалительных и аутоиммунных заболеваний почек, а повышение TGFβ₁ - как ранний маркер развития нефросклероза, в частности, у больных с гломерулонефритами. Увеличение ВИ - TNF-α/ИЛ-10 более чем в 4 раза дает возможность позиционировать его в качестве дополнительного диагностического критерия микробно-воспалительного и аутоим­мунного процесса в почках. Увеличение экскре­ции с мочой TNF-α на фоне снижения ИЛ-10 с сохранением стабильно высоких концентраций TGFβ₁ является маркером воспаления и фиброза при микробно-воспалительных заболеваниях по­чек и гломерулонефритах. В более ранних наших экспериментальных работах мы определили те же данные по этим цитокинам в моче [24].

Таким образом, патологические процессы, лежащие в основе ХБП, сопровождаются изме­нением уровня провоспалительных и противо­воспалительных цитокинов. Гиперпродукция и дефицит цитокинов при ренальной дисфункции способствуют усилению и развитию воспаления различного характера, фиброза и нефросклероза. Предупреждение неблагоприятного исхода и ран­няя диагностика (1-2 стадии) ХБП у детей - одна из актуальных проблем детской нефрологии. Сво­евременная нефропротективная терапия, направ­ленная на торможение прогрессирования ХБП и ее осложнений, должна включать и коррекцию цитокинового статуса.