Диагностический протеомный профиль мочи у пациентов с диабетической нефропатией I стадии при сахарном диабете 2-го типа

ВВЕДЕНИЕ

Одной из главных причин смертности пациен­тов с сахарным диабетом (СД) 2-го типа является диабетическая нефропатия (ДН), которая приво­дит к развитию терминальной почечной недоста­точности [1-5]. В России распространенность ДН при СД 2-го типа в среднем составляет 8%, что ниже мировых показателей в 5 раз. Активное вы­явление пациентов с СД 2-го типа позволяет ду­мать о том, что истинная распространенность ДН в различных регионах России может быть больше в 2-8 раз [2].

Хорошо известно, что ранняя идентификация пациентов, имеющих риск развития ДН, очень важна. Диагностические маркеры, которые се­годня применяются для этого, такие как экскре­ция альбумина с мочой и скорость гломерулярной фильтрации, подвержены существенной вариа­бельности [6], а также имеют невысокую про­гностическую ценность [7]. Точные диагности­ческие методы крайне важны как для разработки мер профилактики ДН, так и для детализации ее интимных механизмов [8]. Моча является интерактомом, который отражает молекулярную информацию о функционировании почек и уро­генитального тракта [9]. Сегодня методы протеомики применяются для оценки профиля пептидов и белков у здоровых субъектов и для сравнения протеома мочи у пациентов с СД с наличием или отсутствием альбуминурии. Пациенты с СД без альбуминурии имеют отличающийся пептидный и белковый паттерн по сравнению с контролем, как и пациенты с альбуминурией демонстрируют индивидуальный полипептидный профиль.

Современные методы и технологии протеом- ного анализа позволяют обнаружить новые про­гностические маркеры и исследовать патологи­ческие пути формирования ДН у пациентов с СД 2-го типа. Сегодня нам необходим прогресс в разработке и клиническом применении новых молекулярных скрининговых тестов, полученных в ходе популяционных исследований и отражаю­щих ключевые геномно-протеомные взаимодей­ствия, которые лежат в основе развития ДН у па­циентов с СД 2-го типа.

Целью настоящего исследования явился поиск диагностического протеомного профиля мочи у пациентов с ДН I стадии (пренефропатия) при СД 2-го типа.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование являлось проспективным когортным сравнительным с параллельным дизай­ном. Исследование выполнено в соответствии с Хельсинской декларацией всемирной медицин­ской ассоциации (1964-2013) и заключением этических комитетов ГБОУ ВПО «Дагестанская государственная медицинская академия» МЗ РФ (г. Махачкала, Россия), ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» МЗ РФ (г. Ростов-на-Дону, Россия).

Обследовали 42 пациента с СД 2-го типа и ДН I стадии (пренефропатия) в соответствии с новой классификации ДН, предложенной Объединенным комитетом по ДН [10]. Критериями включения в исследование были: СД 2-го типа, нормоальбуминурия (альбумин в моче <30 мг/г креатинина), скорость клубочковой фильтрации (СКФ) >30 мл/ мин/1,73 м². Критерии исключения: микро- или ма­кроальбуминурия, протеинурия, СКФ менее 60 мл/ мин/1,73 м². Контрольная группа включала 30 прак­тически здоровых лиц. Риски СД 2-го типа были оценены с помощью Финской шкалы оценки ри­сков СД 2-го типа [11]. Продолжительность СД 2-го типа составила 5,6 года, продолжительность тера­пии - 5 лет. Пациенты получали терапию противодиабетическими (глибенкламид, метформин, пиоглитазон, инсулин гларгин), антигипертензивными (амлодипин, валсартан), гиполипидемическими (фенофибрат) препаратами, антиагрегантами.

На этапе скрининга и сбора данных применяли стандартные методы выявления ДН и СД: оценка жалоб пациента, истории болезни, физикального статуса, амбулаторное мониторирование артери­ального давления, ЭКГ («ATES MEDICA», Ита- лия-Россия), УЗИ почек (допплеровский спектр почечных артерий с оценкой эхогенности корти­кального сегмента почек, «SonoAce R3, Samsung Medison», Южная Корея), общеклинический ана­лиз крови и мочи, биохимический анализ крови и мочи («ELISA, Siemens 2000», Германия), оценка компенсации СД 2 типа на основе уровня HbA1c («Randox Laboratories Ltd.», Великобритания), коагулограмма («Instrumentation Laboratory», США), измерение соотношения альбумин/креатинин в моче, оценка функции почек - гломеруляр­ной фильтрации, эффективного почечного крово­тока методом, предложенным H.Bazzak. Характе­ристика групп представлена в табл. 1.

Качественное молекулярное фенотипирова- ние биообразцов (моча) выполняли с помощью методов протеомики: префракционирование, раз­деление белков с помощью стандартных наборов («MB-HIC C8 Kit, MB-IMAC Cu, MB-Wax Kit», «Bruker», США), время-пролетная матриксная масс-спектрометрии с лазерной десорбцией-ио­низацией («MALDI-TOF-MS/MS, Ultraflex II», «Bruker», США). Масс-спектры регистрировали каждые 3 с в диапазоне m/z 350-3000. Отдельные сиквенсы были идентифицированы в системах «BLAST protein-protein» и в базе данных «Swissprot» для раздела «Homo sapiens» с провер­кой идентифицированных белков в базе данных «MASCOT» («Matrix Science», Великобритания). Данные о межмолекулярных взаимодействиях и функциональной активности получены на основе базы данных «STRING 10.0».

Основываясь на данных стандартных мето­дов идентификации ДН и качественного и коли­чественного молекулярного фенотипирования биообразцов мочи, были предложены новые про­гностические маркеры и молекулярные патологи­ческие пути развития пренефропатии у пациентов с СД 2-го типа.

Статистический анализ полученных данных выполнен с помощью пакета программ «Statistica 12.0» («Statsoft», США). Результаты представ­лены в виде среднего арифметического±ошибка средней. Статистическую значимость различий двух средних определяли с помощью t-критерия Стьюдента; частот - х²-критерия Пирсона. Оцен­ку силы взаимосвязи между количественными признаками проводили с помощью коэффициен­та корреляции (r) Пирсона. Нулевую статистиче­скую гипотезу об отсутствии различий и связей отвергали при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В исследовании мы верифицировали пациен­тов с СД 2-го типа и ДН I стадии (n=42). Клинико­анамнестическая характеристика пациентов с СД 2-го типа и ДН представлена в табл. 1. Параметры коагулограммы, общеклинического анализа кро­ви, уровни мочевой кислоты и калия в сыворотке крови находились в пределах референсных значе­ний у пациентов с СД 2-го типа и ДН i стадии. У 35 пациентов с СД 2-го типа и ДН I стадии выяв­лено достоверное увеличение индексов резистивности для аркуатных или междолевых артерий почек (RI: КГ - 0,60±0,04; группа 1 - 0,81±0,05; p<0,05).

Мы отметили достоверное повышение уров­ней среднего дневного и ночного САД и ДАД, ЧСС (среднее дневное САД: КГ - 115,2±3,1 мм рт. ст., группа 1 - 145,4±4,1 мм рт. ст., p<0,01; среднее дневное ДАД: КГ - 66,7±2,1 мм рт. ст., группа 1 - 82,0±2,8 мм рт. ст., p<0,001; среднее ночное САД: КГ - 115,4±1,8 мм рт. ст., группа 1 - 129,4±2,6 мм рт. ст., p<0,01; среднее ночное ДАД: КГ - 66,8±1,4 мм рт. ст., группа 1 - 81,5±1,7 мм рт. ст., р<0,01; ЧСС: КГ - 79,5±1,3 уд/мин, группа 1 - 85,3±1,5 уд/мин, p<0,05) в группе пациентов с СД 2-го типа и пренефропатией по сравнению с КГ здоровых лиц.

Одновременно выявлена высокая экспрессия пептидов и белков мочи, отражающих прогрес­сирование эпителиально-мезенхимальной транс­формации (ЭМТ) и изменения в экстрацеллюлярном матриксе (ЭМЦ) почек у пациентов с СД 2-го типа и ДН I стадии.

Качественный протеомный анализ способ­ствовал выявлению различий в составе пептидов и белков мочи у пациентов с ДН I стадии в срав­нении с КГ у здоровых лиц. В табл. 2 представ­лен анализ функциональной активности каждого пептида/белка, продемонстрировавший необхо­димость дальнейших исследований и разработки молекулярной патогенетической схемы форми­рования ключевых звеньев ЭМТ и изменений в ЭЦМ почек при ДН в условиях СД 2-го типа.

При биоинформационном анализе были выяв­лены молекулы-участницы универсальных путей возникновения и развития ДН, а также их межмо- лекулярные взаимодействия.

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные в ходе исследования данные стан­дартных инструментальных и лабораторных ме­тодов исследования не способствовали раннему выявлению ДН у пациентов с СД 2 типа. Каче­ственный и количественный протеомный анализ позволил обнаружить увеличение концентрации пептидов и белков в моче с определенными био­логическими функциями и имеющими различную локализацию в интра- и экстрацеллюлярном про­странствах у пациентов с СД 2-го типа и ДН I ста­дии. Можно думать, что эти изменения отражают типичные морфологические особенности процес­са ЭМТ: утолщение базальных мембран и увели­чение гломерулярного мезангиального матрикса, расширение тубулоинтерстициального простран­ства вследствие увеличения ЭЦМ.

Церулоплазмин, в отличие от альбумина, име­ет более высокие молекулярную массу, отрица­тельный заряд и изоэлектрическую точку 4,4 (кис­лый белок) [12]. Мы предполагаем, что высокая экспрессия церулоплазмина в образцах мочи у пациентов с ДН I стадии в сравнении с контро­лем может быть связана либо с изменением заряда базальной мембраны гломерул, либо вследствие нарушения единства гломерулярного барьера при неизмененной тубулярной функции. Вероятно, церулоплазмин является маркером поражения гломерул почек при ДН в самой ее ранней стадии, но необходимы дальнейшие исследования для подтверждения этого факта.

E-кадгерин экспрессирован в мембране и ци­топлазме почечных тубулярных эпителиальных клеток, и отмечено снижение его синтеза здесь при ДН I стадии по сравнению с контролем. E-кадгерин идентифицирован как маркер, связан­ный с ДН I стадии. Мы выявили высокое содержа­ние в моче цистатина С - маркера тубулярного по­вреждения, связанного с возникновением и даль­нейшим прогрессированием ДН. У здоровых лиц цистатин С свободно фильтруется гломерулами почек и весь реабсорбируется в проксимальных канальцах. Увеличение концентрации цистатина С в моче позволяет считать его маркером почеч­ной тубулярной дисфункции [13,14].

Полученные нами данные подтверждают, что высокая концентрация в моче аутокринных фак­торов, в том числе, ТФР β1, макрофагального фактора хемоаттракции-1 и NGAL, связана с раз­витием ДН. Аутокринная сигнальная сеть может стимулировать формирование гипертрофии клу­бочков, расширения мезангиального матрикса и дистрофии проксимальных канальцев. ТФР β1, который активирует киназу рецептора 1 к ТФР β, фосфорилирует рецептор-регулируемые Smads, Smad2 и Smad3, олигомерный комплекс со Smad4 и таргетную генетическую транскрипцию, вклю­чающую Smad7, рассматривается как ключевой медиатор в патогенезе почечного фиброза [15,16]. Сывороточный NGAL фильтруется через гломерулы и полностью реабсорбируется в проксималь­ных канальцах посредством мультилигандного белкового переносчика мегалина в физиологиче­ских условиях. Поврежденные тубулярные клетки могут активно продуцировать связанный с желатиназой липокалин нейтрофилов в качестве ком­пенсаторного механизма против оксидативного стресса и комплемент-индуцированного апоптоза в клетках. Вероятно, при ДН увеличение концен­трации NGAL в моче является результирующей повреждения в гломерулах и тубулярных клетках. Макрофагальный фактор хемоаттракции-1 регу­лирует миграцию и инфильтрацию моноцитов, Т-лимфоцитов памяти, естественных киллеров (NK) в почечной ткани пациентов с ДН.

Мы обнаружили активацию в моче ММП9. Этот факт может быть связан с эксцессивным ее накоплением в ЭМЦ, что приводит к развитию ДН. MMro ремоделирует ЭМЦ на самых ранних стадиях ДН [17].

Появление в моче специфических белков подоцитов также можно рассматривать в качестве ран­них проявлений ДН. Подоциты помогают поддер­живать гломерулярный фильтрационный барьер и защищают от потери белка. Появление подоцина в моче запускает процесс гломеруло склероза посредством увеличения синехий между подоцитами и базальной мембраной гломерул. Подоцин взаимодействует с PBK/AKT-сигнальным патоло­гическим каскадом, обеспечивая функциональное единство. Каждая молекула белка в функциональ­ной группе взаимодействует с другими молекула­ми белков. Пример межмолекулярных взаимодей­ствий подоцина представлен на рисунке.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы идентифицировали новые биомаркеры ДН I стадии при СД 2-го типа, позволяющие развивать неинвазивные диагностические тесты для мочи с целью раннего выявления патологии. Динамика протеомной карты мочи у пациентов с ДН I стадии помогает детализировать молекулярный механизм возникновения и развития ДН. Исследование сигнальных патологических путей и молекул, синтезируемых, секретируемых и формирующих ЭЦМ, может способствовать разработке новых методов профилактики ДН.