Preview

Нефрология

Расширенный поиск

Экспрессия микроРНК-21 в почечной ткани и моче у крыс с односторонней обструкцией мочеточника

Полный текст:

Аннотация

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: оценить уровень экспрессии микроРНК-21 в ткани почек и моче у крыс с односторонней обструкцией мочеточника (ООМ). МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. ООМ вызывали путем перевязки левого мочеточника у крыс-самцов линии Wistar (n=10). Срок наблюдения составил 14 сут после моделирования ООМ. Собирали мочу накануне оперативного вмешательства (UmiRNA21C) и за сутки до окончания эксперимента (UmiRNA21I), в течение 24 ч. При выведении животного из эксперимента производили забор пробы мочи из лоханки левой почки (UmiRNA21O) и образцов ткани левой (KmiRNA21O) и правой (KmiRNA21I) почек. Экспрессия миРНК-21 в ткани почек и моче при помощи реакции амплификации (RealTime PCR-протокол). Расчет проводился по методу 2-deltaCt. Статистический анализ результатов выполняли с использованием пакета прикладных статистических программ «Statistics v6.0 (StatSoft Inc», США). Результаты представлены как медиана [нижний - верхний квартиль]. Для попарного сравнения использовали критерий Вилкоксона для связанных групп, для оценки силы связи между изучаемыми переменными -коэффициент ранговой корреляции Спирмена. РЕЗУЛЬТАТЫ. UmiRNA21I (3,78[2,0-5,28]) и UmiRNA21O (3,78[3,25-3,82]) оказались значимо выше, чем UmiRNA21C (1,15[0,71-1,74]; р=0,0125 и р=0,0069, respectively). Величины UmiRNA21I и UmiRNA21O оказались практически одинаковыми. В почках с ООМ тканевой уровень экспрессии миРНК-21 был несколько выше, чем в контралатеральном органе (р=0,0926). Выявлена значимая прямая корреляция между KmiRNAI и KmiRNAO (RS=0,770, р=0,0092). ЗАКЛЮЧЕНИЕ. ООМ вызывает специфические изменения в экспрессии, распределении и выведении миРНК-21. Однако механизмы активации данной миРНК при почечной патологии и ее роль в развитии почечного тубулоинтерстициального фиброза требуют дальнейших исследований.

Для цитирования:


Каюков И.Г., Иванова Г.Т., Зарайский М.И., Береснева О.Н., Парастаева М.М., Кучер А.Г., Смирнов А.В. Экспрессия микроРНК-21 в почечной ткани и моче у крыс с односторонней обструкцией мочеточника. Нефрология. 2016;20(5):84-89.

For citation:


Kayukov I.G., Ivanova G.T., Zaraiskii M.I., Beresneva O.N., Parastaeva M.M., Kucher A.G., Smirnov A.V. Expression miRNA-21 in renal tissue and urine in rats with unilateral ureteral obstruction. Nephrology (Saint-Petersburg). 2016;20(5):84-89. (In Russ.)

ВВЕДЕНИЕ

МикроРНК (миРНК) - это некодирующие РНК, включающие, в среднем, около 22 пар ну­клеотидов. Считается, что эти РНК вовлечены в прогрессирование целого ряда заболеваний [1-6]. Они являются регуляторами экспрессии генов на посттранскрипционном уровне. Более 90% генов у млекопитающих находится под их контролем.

К настоящему времени в геноме человека опи­сано более 2000 миРНК [7-10]. МиРНК-21 до­вольно обильно экспрессируется и во многих дру­гих тканях и клетках человека. Она является наи­более изученной многофункциональной миРНК. Ее ген локализуется в межгенной области хро­мосомы 17q23,1, размер - 72 пары нуклеотидов, фланкирован белок-кодирующим геном TMEM49. Ген миРНК-21 имеет свой собственный промотор и транскрибируется вне зависимости от TMEM49. МиРНК-21 нокаутные мыши являются жизнеспособными, дают потомство и не имеют отличий в гистологии. Эти данные позволили сделать вывод о том, что миРНК-21 не является обязательным компонентом для нормального развития организ­ма [11].

В настоящее время активно изучается воз­можное участие миРНК в механизмах развития повреждения почечной ткани при различных за­болеваниях. При большинстве поражений почек развитие фиброза определяется комплексом ме­ханизмов (иммуновоспалительных, метаболиче­ских, гемодинамических), точную грань между ролью которых провести невозможно [12]. Однако на конечном этапе формирования фиброза основ­ную роль играет экспрессия провоспалительных и профибротических цитокинов, которые, зача­стую, начинают действовать вне зависимости от причин, вызвавших их активацию. Результаты не­которых исследований позволяют предположить, что миРНК-21 играет ведущую роль в развитии эпителиально-мезенхимальной трансформации и ренального фиброза [11, 13-15]. Однако сведений о деталях экспрессии миРНК-21 и ее последстви­ях в таких ситуациях недостаточно.

В связи с этим целью нашей работы было оце­нить уровень экспрессии миРНК-21 в ткани почек и моче у крыс Wistar с односторонней обструкци­ей мочеточника (ООМ) - классической моделью экспериментального тубулоинтерстициального фиброза.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для создания экспериментальной модели ту- булоинтерстициального фиброза на фоне ООМ были использованы самцы крыс Wistar (n=10) массой 230-250 г (питомник «Колтуши» РАН).

Методика выполнения оперативного вме­шательства. Под общей анестезией, ксилазин (0,05 мл) в сочетании с тилетамином/золазепамом (0,3 мл), внутрибрюшинно выполняли перевязку левого мочеточника. На мочеточник накладывали 2 лигатуры (использовали шелк 2/0 Silkam). Участок мочеточника между лигатурами перерезали. Пра­вую почку (с неповрежденным мочеточником) ис­пользовали в качестве контроля [16]. Срок наблю­дения составил 14 сут после моделирования ООМ.

Накануне оперативного вмешательства и за сутки до окончания эксперимента у крыс, на­ходящихся в метаболической камере, в течение 24 ч собирали мочу для последующего определе­ния экспрессии миРНК-21 (контрольная порция мочи - UmiRNA21C и моча из интактной почки - UmiRNA21I соответственно). При выведении жи­вотного из эксперимента у каждой крысы произ­водили забор (с помощью шприца) пробы мочи из лоханки левой почки (моча из почки с обструкци­ей мочеточника - UmiRNA21O) и образцов ткани левой (KmiRNA21O) и правой (KmiRNA21I) почек для определения экспрессии миРНК-21.

Эксперименты выполняли в соответствии с международными стандартами по работе с лабо­раторными животными с разрешения этического комитета Первого Санкт-Петербургского государ­ственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова.

Экспрессия миРНК-21 в ткани почек и моче экспериментальных животных определялась при помощи реакции амплификации (RealTime PCR- протокол). Расчет проводился по методу 2-deltaCt.

Статистический анализ результатов выпол­няли с использованием пакета прикладных ста­тистических программ «Statistica v 6.0 («StatSoft Inc», США). Результаты представлены как медиа­на [нижний - верхний квартиль]. Для попарного сравнения использовали критерий Вилкоксона для связанных групп, для оценки силы связи меж­ду изучаемыми переменными - коэффициент ран­говой корреляции Спирмена. Нулевую статисти­ческую гипотезу об отсутствии различий и связей отвергали при p<0,05.

 

Таблица

Матрица корреляций между уровнями относительной экспрессии миРНК-21в моче и почечной ткани у исследованных животных (Rs)

Коррелируемые показатели

UmiRNA21C

UmiRNA21I

UmiRNA21O

KmiRNA21I

KmiRNA21O

UmiRNA21C

-

-0,067

0,043

-0,213

-0,249

UmiRNA21I

-0,067

-

-0,448

-0,236

-0,212

UmiRNA21O

0,043

-0,448

-

0,067

0,117

KmiRNA21I

-0,213

-0,236

0,067

-

0,770

KmiRNA21O

-0,249

-0,212

0,117

0,770

-

Примечание. Статистически значимые коэффициенты выделены жирным шрифтом.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

Через 14 дней после оперативного вмеша­тельства экспрессия микроРНК значительно по­вышалась как в моче из интактной почке (UmiR- NA21I: 3,78 [2,0-5,28]), так и в моче из почки с перевязанным мочеточником (UmiRNA21O: 3,78 [3,25-3,82]) по сравнению с контрольными пока­зателями (UmiRNA21O: 1,15 [0,71-1,74], р=0,012 и р=0,006 соответственно; рис. 1 и 2). Уровни относительной экспрессии миРНК-21 в моче из неповрежденных почек и органов с обструкцией мочеточника на 14-е сутки эксперимента были практически одинаковыми (р = 0,953).

В тканях почек с обструкцией мочеточни­ка уровень экспрессии миРНК-21 (19,22 [4,92-45,25]) был больше, чем в неповрежденном ор­гане (9,38 [0,66-27,86]). Однако эти различия не достигали статистической значимости (p=0,092).

 

Рис. 1. Экспрессия миРНК-21 в контрольной порции мочи и моче из интактной почки.

 

 

Рис. 2. Экспрессия миРНК-21 в контрольной порции мочи и моче из почки с обструкцией мочеточника.

Была выявлена прямая корреляция между уровнями экспрессии миРНК-21 в тканях почек с обструкцией мочеточника и интактных почках (Rs = 0,770, p=0,009). Все остальные изученные ассоциации оказались статистически незначимы­ми (таблица).

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе в моче и почечной ткани крыс с ООМ, как и во многих экспериментальных исследованиях механизмов развития почечно­го фиброза, выявлялось повышение экспрессии миРНК [13,17]. Более того, в нашей предыдущей работе у пациентов с различными нефропатиями также была обнаружена более высокая мочевая экспрессия миРНК-21, чем у здоровых лиц. При этом у больных с большей выраженностью тубу­лярной атрофии величина экспрессии миРНК-21 в моче оказалась выше [18].

Установлено, что при повреждении тканей, особенно при инфаркте миокарда [19,20] и остром повреждении почек [21], миРНК-21 является одной из наиболее активируемых. Длительная из­быточная активация миРНК-21 ведет к разраста­нию соединительной ткани. Этот факт подтверж­ден в целом ряде моделей сердечного [22], легоч­ного [23] и почечного [15, 24] фиброза. В тоже время, введение олигонуклеотидов - ингибиторов миРНК-21 замедляет процессы фиброзирования тканей [15, 24].

Молекулярные механизмы участия миРНК-21 в развитии фиброза в последние годы актив­но изучаются. Одним из них является TGFβ/ Smad-система, которая стимулирует нуклеарный фактор транскрипции NFkB, который, в свою очередь, опосредует выработку провоспалительных цитокинов, прежде всего, фактора некроза опухолей-α (TNF-α) и интерлейкина-1β (IL-1 β) [4, 14, 15, 24].

Не вызывает сомнения, что TGFβ1 является ключевым медиатором прогрессирования по­чечного фиброза [25, 26]. В наших предыдущих работах на крысах с ООМ также было выявлено повышение активности как нуклеарного факто­ра транскрипции NFkB, так и TGFβ1 в почечной ткани [4, 27]. TGFβ1 и его изоформы (TGFβ2 и TGFβ3) синтезируются многими клетками, вклю­чая все типы клеток почек, и секретируются в виде латентных предшественников. Связывание акти­вированного TGFβ со своим рецептором приводит к фосфорилированию ряда Smad (Sma and Mad related proteins) белков, а именно, активируемых рецептором Smads (R-Smads). R-Smads затем свя­зываются с так называемым общим Smad-белком (Smad4), образуя гетеродимерный комплекс. Этот комплекс проникает в ядро, где связываясь с SBE- элементами (Smad binding element) промотерных участков генов-мишеней, регулирует транскрип­цию. Так, одно исследование показало, что R- Smads в фибробластах, гладкомышечных клет­ках сосудов, эпителиальных клетках канальцев связываются с SBE-элементом, расположенном в промоторе гена миРНК-21, запуская таким об­разом транскрипцию ее предшественников [24, 28]. миРНК-21, в свою очередь, подавляет Smad7, который является ингибитором TGFβ/Smad-пути. Возможны также и другие механизмы, при по­мощи которых миРНК-21 способствует прогрес­сированию фиброза, например, активация ERK/ MAP-киназы [22].

Необходимо отметить, что уровень экспрес­сии миРНК-21 в моче значимо повышается при нарастании выраженности атрофии канальцев от незначительной до умеренной. При этом в экспе­риментальных работах показано, что наибольшая экспрессия миРНК-21 характерна для эпителиаль­ных клеток канальцев [15]. Почечный фиброз ха­рактеризуется апоптозом и некрозом тубулярных клеток, лейкоцитарной инфильтрацией, пролифе­рацией тубулоинтерстициальных фибробластов и накоплением интерстициального матрикса [24] и является конечной стадией повреждения почек.

Полученные данные, по крайней мере, не противоречат предположению о том, что ООМ может активировать экспрессию миРНК-21 в по­чечной ткани, что далее модулирует деятельность миРНК-21-ассоциированных сигнальных путей формирования почечного фиброза. Однако осо­бенностью результатов настоящего исследования является обнаружение того, что односторонняя перевязка мочеточника приводит к нарастанию экспрессии миРНК-21 в моче не только из повреж­денной, но и из интактной контралатеральной почки. При этом уровни такой экспрессии ока­зываются практически идентичными. Отмечена также тенденция к более высоким значениям ак­тивации миРНК-21 в почке с ООМ по сравнению с интактной и статистически значимая прямая связь между этими показателями. Все это позво­ляет несколько расширить взгляды о механизмах индукции экспрессии миРНК в условиях патоло­гии, но не дает ответа на существенный вопрос: какой механизм лежит в основе усиления экспрес­сии миРНК-21 в моче, полученной из контралате­ральной почки? Возможно, в таких условиях эта миРНК из почки с обструкцией высвобождается в системный кровоток и далее попадает в контрала­теральный орган и далее в мочу. Однако, такая ин­терпретации встречает существенное возражение. Как тогда объяснить отсутствие значимых связей между экспрессией миРНК-21 в почечной ткани и моче? Не исключено, например, что использо­ванное экспериментальное воздействие вообще приводит к усилению экспрессии миРНК-21 на системном уровне за счет неустановленных меха­низмов. Очевидно, что данные проблемы требуют дополнительного изучения. Тем не менее, стоит иметь в виду, что полученные данные призывают проявить осторожность к использованию мочевой экспрессии миРНК-21, как маркера повреждения почек (почечного фиброза) в клинике. Такая на­стороженность должна сохраняться, по крайней мере, до тех пор, пока маркерная роль мочевой миРНК-21 не будет четко доказана не только в экспериментальных, но и клинических исследо­ваниях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, односторонняя обструкция мочеточника вызывает специфические измене­ния в экспрессии, распределении и выведении миРНК-21. Однако механизмы активации при по­чечной патологии данной миРНК и ее роль в раз­витии почечного тубулоинтерстициального фи­броза требуют дальнейших исследований.

Список литературы

1. Kataoka M, Wang DZ. Non-Coding RNAs Including miRNAs and lncRNAs in Cardiovascular Biology and Disease. Cells 2014; 3(3): 883-898

2. Condorelli G, Latronico MV, Cavarretta E. microRNAs in cardiovascular diseases: current knowledge and the road ahead. J Am Coll Cardiol 2014; 63(21): 2177-2187

3. Gharipour M, Sadeghi M. Pivotal role of microRNA-33 in metabolic syndrome: A systematic review. ARYA Atheroscler 2013;

4. Смирнов АВ, Кучер АГ, Добронравов ВАидр. Диетарный соевый протеин замедляет развитие интерстициального почечного фиброза у крыс с односторонней обструкцией мочеточника: введение в нутритивную эпигеномику. Нефрология 2012; 16(4):75-83

5. Adams BD, Kasinski AL, Slack FJ. Aberrant Regulation and Function of MicroRNAs in Cancer. Curr Biol 2014; 24(16): R762-R776

6. Qingqing W, Qing-Sheng M, Zheng D. The regulation and function of microRNAs in kidney diseases. IUBMB Life 2013; 65(7): 602-614

7. Kozomara A, Griffiths-Jones S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Res 2011; 39: D152-157

8. Landgraf P, Rusu M, Sheridan R et al. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell 2007; 129(7): 1401-1414

9. Sun X Koo S, White N et al. Development of a micro-array to detect human and mouse microRNAs and characterization of expression in human organs. Nucleic Acids Res 2004; 32(22): e188

10. Chandrasekaran K, Karolina DS, Sepramaniam S et al. Role of microRNAs in kidney homeostasis and disease. Kidney Int 2012; 81(7): 617-627

11. Kumarswamy R, Volkmann I, Thum T. Regulation and function of miRNA-21 in health and disease. RNA Biol 2011; 8(5): 706-713

12. Lan HY Diverse Roles of TGF-ß/Smads in Renal Fibrosis and Inflammation. Int J Biol Sci 2011; 7(7): 1056-1067

13. Duffield JS, Grafals M, Portilla D. MicroRNAs are potential therapeutic targets in fibrosing kidney disease: lessons from animal models. Drug Discov Today Dis Models 2013; 10(3):e127-e135

14. Patel V, Noureddine L. MicroRNAs and fibrosis. Curr Opin Nephrol Hypertens 2012; 21(4): 410-416

15. Zarjou A, Yang S, Abraham E et al. Identification of a microRNA signature in renal fibrosis: role of miR-21. Am J Physiol Renal Physiol 2011; 301(4): F793-F801

16. Береснева ОН, Парастаева ММ, Иванова ГТ и др. Влияние метформина на формирование тубулоинтерстициального фиброза у крыс. Нефрология 2014; 19(6): 45-48 [Beresneva ON, Parastaeva MM, Ivanova GT i dr. Vl^nie metformina na formirovanie tubulointersticial’nogo fibroza u krys. Nefrologijа 2014; 19(6): 45-48]

17. Chung AC, Lan HY MicroRNAs in renal fibrosis. Front Physiol 2015; 6:50. doi: 10.3389/fphys.2015.00050

18. Cмирнов АВ, Карунная АВ, Зарайский МИ и др. Экспрессия микроРНК-21 в моче у пациентов с нефропатиями. Нефрология 2014; 18(6): 59-63

19. D’Alessandra Y, Devanna P, Limana F et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J 2010; 31(22): 2765-2773

20. Shi B, Guo Y Wang J, Gao W. Altered expression of microRNAs in the myocardium of rats with acute myocardial infarction. BMC Cardiovasc Disord 2010; 10:11

21. Godwin JG, Ge X, Stephan K et al. Identification of a microRNA signature of renal ischemia-reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107: 14339-14344

22. Thum T, Gross C, Fiedler J et al. MicroRNA-21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase signalling in fibroblasts. Nature 2008; 456: 980-984

23. Liu G, Friggeri A, Yang Y et al. miR-21 mediates fibrogenic activation of pulmonary fibroblasts and lung fibrosis. J Exp Med 2010; 207: 1589-1597

24. Zhong X, Chung AC, Chen HY et al. Smad3-mediated upregulation of miR-21 promotes renal fibrosis. J Am Soc Nephrol 2011; 22: 1668-1681

25. Bottinger EP. TGF-beta in renal injury and disease. Semin Nephrol 2007; 27: 309-320

26. Wang W, Koka V, Lan HY Transforming growth factor-beta and Smad signalling in kidney diseases. Nephrology (Carlton) 2005;10(1):48-56

27. Смирнов АВ, Иванова ГТ, Береснева ОН и др. Экспериментальная модель интерстициального почечного фиброза. Нефрология 2009; 13(4): 70-74 [Smirnov AV, Ivanova GT, Beresneva ON i dr. Yeksperimental’najа model’ intersticial’nogo pochechnogo fibroza. Nefrologijа 2009; 13(4): 70-74]

28. Davis BN, Hilyard AC, Lagna G, Hata A. SMAD proteins control DROSHA-mediated microRNA maturation. Nature 2008;454:56-61


Об авторах

И. Г. Каюков
Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
Россия


Г. Т. Иванова
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН
Россия


М. И. Зарайский
Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им.акад. И.П. Павлова
Россия


О. Н. Береснева
Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
Россия


М. М. Парастаева
Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
Россия


А. Г. Кучер
Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
Россия


А. В. Смирнов
Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
Россия


Для цитирования:


Каюков И.Г., Иванова Г.Т., Зарайский М.И., Береснева О.Н., Парастаева М.М., Кучер А.Г., Смирнов А.В. Экспрессия микроРНК-21 в почечной ткани и моче у крыс с односторонней обструкцией мочеточника. Нефрология. 2016;20(5):84-89.

For citation:


Kayukov I.G., Ivanova G.T., Zaraiskii M.I., Beresneva O.N., Parastaeva M.M., Kucher A.G., Smirnov A.V. Expression miRNA-21 in renal tissue and urine in rats with unilateral ureteral obstruction. Nephrology (Saint-Petersburg). 2016;20(5):84-89. (In Russ.)

Просмотров: 113


ISSN 1561-6274 (Print)
ISSN 2541-9439 (Online)