Экспрессия микроРНК-21 в почечной ткани и моче у крыс с односторонней обструкцией мочеточника

ВВЕДЕНИЕ

МикроРНК (миРНК) - это некодирующие РНК, включающие, в среднем, около 22 пар ну­клеотидов. Считается, что эти РНК вовлечены в прогрессирование целого ряда заболеваний [1-6]. Они являются регуляторами экспрессии генов на посттранскрипционном уровне. Более 90% генов у млекопитающих находится под их контролем.

К настоящему времени в геноме человека опи­сано более 2000 миРНК [7-10]. МиРНК-21 до­вольно обильно экспрессируется и во многих дру­гих тканях и клетках человека. Она является наи­более изученной многофункциональной миРНК. Ее ген локализуется в межгенной области хро­мосомы 17q23,1, размер - 72 пары нуклеотидов, фланкирован белок-кодирующим геном TMEM49. Ген миРНК-21 имеет свой собственный промотор и транскрибируется вне зависимости от TMEM49. МиРНК-21 нокаутные мыши являются жизнеспособными, дают потомство и не имеют отличий в гистологии. Эти данные позволили сделать вывод о том, что миРНК-21 не является обязательным компонентом для нормального развития организ­ма [11].

В настоящее время активно изучается воз­можное участие миРНК в механизмах развития повреждения почечной ткани при различных за­болеваниях. При большинстве поражений почек развитие фиброза определяется комплексом ме­ханизмов (иммуновоспалительных, метаболиче­ских, гемодинамических), точную грань между ролью которых провести невозможно [12]. Однако на конечном этапе формирования фиброза основ­ную роль играет экспрессия провоспалительных и профибротических цитокинов, которые, зача­стую, начинают действовать вне зависимости от причин, вызвавших их активацию. Результаты не­которых исследований позволяют предположить, что миРНК-21 играет ведущую роль в развитии эпителиально-мезенхимальной трансформации и ренального фиброза [11, 13-15]. Однако сведений о деталях экспрессии миРНК-21 и ее последстви­ях в таких ситуациях недостаточно.

В связи с этим целью нашей работы было оце­нить уровень экспрессии миРНК-21 в ткани почек и моче у крыс Wistar с односторонней обструкци­ей мочеточника (ООМ) - классической моделью экспериментального тубулоинтерстициального фиброза.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для создания экспериментальной модели ту- булоинтерстициального фиброза на фоне ООМ были использованы самцы крыс Wistar (n=10) массой 230-250 г (питомник «Колтуши» РАН).

Методика выполнения оперативного вме­шательства. Под общей анестезией, ксилазин (0,05 мл) в сочетании с тилетамином/золазепамом (0,3 мл), внутрибрюшинно выполняли перевязку левого мочеточника. На мочеточник накладывали 2 лигатуры (использовали шелк 2/0 Silkam). Участок мочеточника между лигатурами перерезали. Пра­вую почку (с неповрежденным мочеточником) ис­пользовали в качестве контроля [16]. Срок наблю­дения составил 14 сут после моделирования ООМ.

Накануне оперативного вмешательства и за сутки до окончания эксперимента у крыс, на­ходящихся в метаболической камере, в течение 24 ч собирали мочу для последующего определе­ния экспрессии миРНК-21 (контрольная порция мочи - UmiRNA21_C и моча из интактной почки - UmiRNA21_I соответственно). При выведении жи­вотного из эксперимента у каждой крысы произ­водили забор (с помощью шприца) пробы мочи из лоханки левой почки (моча из почки с обструкци­ей мочеточника - UmiRNA21_O) и образцов ткани левой (KmiRNA21_O) и правой (KmiRNA21_I) почек для определения экспрессии миРНК-21.

Эксперименты выполняли в соответствии с международными стандартами по работе с лабо­раторными животными с разрешения этического комитета Первого Санкт-Петербургского государ­ственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова.

Экспрессия миРНК-21 в ткани почек и моче экспериментальных животных определялась при помощи реакции амплификации (RealTime PCR- протокол). Расчет проводился по методу 2^-deltaCt.

Статистический анализ результатов выпол­няли с использованием пакета прикладных ста­тистических программ «Statistica v 6.0 («StatSoft Inc», США). Результаты представлены как медиа­на [нижний - верхний квартиль]. Для попарного сравнения использовали критерий Вилкоксона для связанных групп, для оценки силы связи меж­ду изучаемыми переменными - коэффициент ран­говой корреляции Спирмена. Нулевую статисти­ческую гипотезу об отсутствии различий и связей отвергали при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Через 14 дней после оперативного вмеша­тельства экспрессия микроРНК значительно по­вышалась как в моче из интактной почке (UmiR- NA21_I: 3,78 [2,0-5,28]), так и в моче из почки с перевязанным мочеточником (UmiRNA21_O: 3,78 [3,25-3,82]) по сравнению с контрольными пока­зателями (UmiRNA21_O: 1,15 [0,71-1,74], р=0,012 и р=0,006 соответственно; рис. 1 и 2). Уровни относительной экспрессии миРНК-21 в моче из неповрежденных почек и органов с обструкцией мочеточника на 14-е сутки эксперимента были практически одинаковыми (р = 0,953).

В тканях почек с обструкцией мочеточни­ка уровень экспрессии миРНК-21 (19,22 [4,92-45,25]) был больше, чем в неповрежденном ор­гане (9,38 [0,66-27,86]). Однако эти различия не достигали статистической значимости (p=0,092).

Была выявлена прямая корреляция между уровнями экспрессии миРНК-21 в тканях почек с обструкцией мочеточника и интактных почках (Rs = 0,770, p=0,009). Все остальные изученные ассоциации оказались статистически незначимы­ми (таблица).

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе в моче и почечной ткани крыс с ООМ, как и во многих экспериментальных исследованиях механизмов развития почечно­го фиброза, выявлялось повышение экспрессии миРНК [13,17]. Более того, в нашей предыдущей работе у пациентов с различными нефропатиями также была обнаружена более высокая мочевая экспрессия миРНК-21, чем у здоровых лиц. При этом у больных с большей выраженностью тубу­лярной атрофии величина экспрессии миРНК-21 в моче оказалась выше [18].

Установлено, что при повреждении тканей, особенно при инфаркте миокарда [19,20] и остром повреждении почек [21], миРНК-21 является одной из наиболее активируемых. Длительная из­быточная активация миРНК-21 ведет к разраста­нию соединительной ткани. Этот факт подтверж­ден в целом ряде моделей сердечного [22], легоч­ного [23] и почечного [15, 24] фиброза. В тоже время, введение олигонуклеотидов - ингибиторов миРНК-21 замедляет процессы фиброзирования тканей [15, 24].

Молекулярные механизмы участия миРНК-21 в развитии фиброза в последние годы актив­но изучаются. Одним из них является TGFβ/ Smad-система, которая стимулирует нуклеарный фактор транскрипции NFkB, который, в свою очередь, опосредует выработку провоспалительных цитокинов, прежде всего, фактора некроза опухолей-α (TNF-α) и интерлейкина-1β (IL-1 β) [4, 14, 15, 24].

Не вызывает сомнения, что TGFβ1 является ключевым медиатором прогрессирования по­чечного фиброза [25, 26]. В наших предыдущих работах на крысах с ООМ также было выявлено повышение активности как нуклеарного факто­ра транскрипции NFkB, так и TGFβ1 в почечной ткани [4, 27]. TGFβ1 и его изоформы (TGFβ2 и TGFβ3) синтезируются многими клетками, вклю­чая все типы клеток почек, и секретируются в виде латентных предшественников. Связывание акти­вированного TGFβ со своим рецептором приводит к фосфорилированию ряда Smad (Sma and Mad related proteins) белков, а именно, активируемых рецептором Smads (R-Smads). R-Smads затем свя­зываются с так называемым общим Smad-белком (Smad4), образуя гетеродимерный комплекс. Этот комплекс проникает в ядро, где связываясь с SBE- элементами (Smad binding element) промотерных участков генов-мишеней, регулирует транскрип­цию. Так, одно исследование показало, что R- Smads в фибробластах, гладкомышечных клет­ках сосудов, эпителиальных клетках канальцев связываются с SBE-элементом, расположенном в промоторе гена миРНК-21, запуская таким об­разом транскрипцию ее предшественников [24, 28]. миРНК-21, в свою очередь, подавляет Smad7, который является ингибитором TGFβ/Smad-пути. Возможны также и другие механизмы, при по­мощи которых миРНК-21 способствует прогрес­сированию фиброза, например, активация ERK/ MAP-киназы [22].

Необходимо отметить, что уровень экспрес­сии миРНК-21 в моче значимо повышается при нарастании выраженности атрофии канальцев от незначительной до умеренной. При этом в экспе­риментальных работах показано, что наибольшая экспрессия миРНК-21 характерна для эпителиаль­ных клеток канальцев [15]. Почечный фиброз ха­рактеризуется апоптозом и некрозом тубулярных клеток, лейкоцитарной инфильтрацией, пролифе­рацией тубулоинтерстициальных фибробластов и накоплением интерстициального матрикса [24] и является конечной стадией повреждения почек.

Полученные данные, по крайней мере, не противоречат предположению о том, что ООМ может активировать экспрессию миРНК-21 в по­чечной ткани, что далее модулирует деятельность миРНК-21-ассоциированных сигнальных путей формирования почечного фиброза. Однако осо­бенностью результатов настоящего исследования является обнаружение того, что односторонняя перевязка мочеточника приводит к нарастанию экспрессии миРНК-21 в моче не только из повреж­денной, но и из интактной контралатеральной почки. При этом уровни такой экспрессии ока­зываются практически идентичными. Отмечена также тенденция к более высоким значениям ак­тивации миРНК-21 в почке с ООМ по сравнению с интактной и статистически значимая прямая связь между этими показателями. Все это позво­ляет несколько расширить взгляды о механизмах индукции экспрессии миРНК в условиях патоло­гии, но не дает ответа на существенный вопрос: какой механизм лежит в основе усиления экспрес­сии миРНК-21 в моче, полученной из контралате­ральной почки? Возможно, в таких условиях эта миРНК из почки с обструкцией высвобождается в системный кровоток и далее попадает в контрала­теральный орган и далее в мочу. Однако, такая ин­терпретации встречает существенное возражение. Как тогда объяснить отсутствие значимых связей между экспрессией миРНК-21 в почечной ткани и моче? Не исключено, например, что использо­ванное экспериментальное воздействие вообще приводит к усилению экспрессии миРНК-21 на системном уровне за счет неустановленных меха­низмов. Очевидно, что данные проблемы требуют дополнительного изучения. Тем не менее, стоит иметь в виду, что полученные данные призывают проявить осторожность к использованию мочевой экспрессии миРНК-21, как маркера повреждения почек (почечного фиброза) в клинике. Такая на­стороженность должна сохраняться, по крайней мере, до тех пор, пока маркерная роль мочевой миРНК-21 не будет четко доказана не только в экспериментальных, но и клинических исследо­ваниях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, односторонняя обструкция мочеточника вызывает специфические измене­ния в экспрессии, распределении и выведении миРНК-21. Однако механизмы активации при по­чечной патологии данной миРНК и ее роль в раз­витии почечного тубулоинтерстициального фи­броза требуют дальнейших исследований.