МЕХАНИЗМЫ ОТТОРЖЕНИЯ ПОЧЕЧНОГО АЛЛОТРАНСПЛАНТАТА И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ТОЛЕРАНТНОСТЬ

ВВЕДЕНИЕ

Одной из главных и постоянных проблем при аллотрансплантации трупной почки (АТТП) по-прежнему остается риск отторжения почечного аллотрансплантата (ПАТ) [1]. Приблизительно 5-10% реципиентов в течение 1 года после пере­садки почки возвращаются к программам гемоди­ализа в связи с дисфункцией трансплантата [2], а с удлинением времени после трансплантации та­ких пациентов становится все больше [3]. Поэто­му представляется крайне важным обеспечить со­хранность и максимальную эффективность функ­ционирования ПАТ.

На современном этапе развития трансплан­тологии иммуно супрессия является безальтер­нативным методом предупреждения и лечения реакции отторжения. Совершенствование схем и протоколов иммуносупрессии помогло снизить риск развития данного осложнения [4, 5]. Одна­ко это полностью не решило проблему отторже­ния, а токсичность и побочные эффекты, связан­ные с приемом иммуносупрессантов, вынуждают производить поиск новых препаратов и методов лечения, основанных на глубоком изучении им­мунологических механизмов отторжения ПАТ и формирования толерантности к пересаженному органу.

Отторжение почечного аллотрансплантата

Отторжение трансплантированных тканей происходит в результате того, что иммунная си­стема реципиента распознает чужеродные тка­невые антигены гистосовместимости на клетках трансплантата и реагирует на них. Во многом благодаря исследованиям приживления и оттор­жения пересаженных тканей в животных моделях были открыты молекулы главного комплекса ги­стосовместимости (ГКГ или MHC), кодирование которого располагается в гене на коротком плече 6-й хромосомы [6]. Продукты генов - антигены или молекулы MHCобладают крайне выражен­ным полиморфизмом [7]. Обнаружено, что при сингенных пересадках, например, при пересад­ках тканей между однояйцевыми близнецами, которые имеют одинаковые молекулы MHC, как правило, отторжения не происходит. В то время как при аллогенных трансплантациях, когда до­нор и реципиент различаются по антигенам MHC, отсутствие приема иммуносупрессии приведет к неминуемому отторжению [8].

Существуют три типа молекул MHC: класса I, II и III. У людей гены MHC называются гена­ми лейкоцитарных антигенов человека (human leukocyte antigen - HLA). В их состав входят сле­дующие гены (рис. 1):

• класс I - HLA-A, HLA-B иHLA-C;
• класс II - HLA-DP, HLA-DQ иHLA-DR;
• класс III - C4a, C2, C4b, Bf.

Молекулы MHC I класса располагаются прак­тически на всех ядросодержащих клетках и пре- зентируют пептид, состоящий из 9-11 аминокис­лот. Молекулы MHC II класса обнаруживаются только на специализированных антигенпрезентирующих клетках (АПК), к которым относятся дендритные клетки, В-лимфоциты и макрофаги, они связывают пептиды длиной 13-30 аминокис­лот [9]. К тому же экспрессия антигенов MHC значительно увеличивается под действием цитокинов - интерферона-γ (ИФНγ) и фактора некроза опухолей (ФНОα), что безусловно играет важную роль в развитии иммунологической реакции [10].

К продуктам генов MHC III класса относят некоторые компоненты системы комплемента, ФНО-α, белки теплового шока и др. Они не игра­ют существенной роли в реакциях тканевой несо­вместимости.

Молекулы MHC имеют две существенные осо­бенности, использующиеся в трансплантацион­ной иммунологии [8]. Первая особенность заклю­чается в том, что всякий локус в молекуле MHC полиморфен. Различий в молекулах HLA-A1 и HLA-A2 вполне достаточно для запуска реакции отторжения. Совокупность разных молекул MHC (аллелей), экспрессируемых одной хромосомой, называется гаплотипом. Генотип - сумма двух гаплотипов.

Второй особенностью является кодоминантность экспрессии генов. MHC экспрессируются кодоминантно, т.е. у каждого индивидуума в каж­дом локусе проявляются аллели обеих хромосом. Следовательно, MHC-генотип индивида пред­ставлен 12 различными молекулами MHC (по два аллеля каждого из шести локусов) (рис. 2). Поэтому, согласно законам Менделя, трансплан­тат, пересаженный от родителей, отторгается их потомками и наоборот.

Известно, что именно несовместимость MHC донора и реципиента вызывает иммунный ответ против трансплантата, приводящий в конечном итоге к его разрушению. Также, помимо антигенов MHC, выделяют минорные антигены гистовме­стимости. Они, по-видимому, играют небольшую роль в процессе отторжения, за исключением тех случаев, когда главные комплексы гистосовмести­мости совпадают, но имеются ряд незначитель­ных отличий в минорных антигенах гистосовме­стимости. В этих случаях также может произойти отторжение трансплантата. О минорных антиге­нах человека известно очень мало, однако суще­ствуют сообщения, что несовпадение по данной системе антигенов у однояйцовых близнецов при­водит к отторжению трансплантата [11].

Основная функция MHC - участие в инициа­ции Т-клеточного иммунного ответа через рас­познавание Т-клеточным рецептором комплекса MHC-пептид [12]. Трансплантированные органы экспрессируют молекулы MHC донора, в резуль­тате чего происходит распознавание аллоанти­генов трансплантата по двум путям (рис. 3) [8]. При снижении экспрессии MHC I класса на ядро­содержащих клетках происходит их узнавание NK-клетками с последующим их цитолизом или апоптозом.

Прямое распознавание происходит через взаи­модействие Т-клеток реципиента и аллогенных молекул MHC, экспрессированных на донорских клетках. Такое взаимодействие объясняется мо­лекулярной мимикрией, т.е. аллогенные MHC на­поминают собственные молекулы MHC, поэтому пептид, который они презентируют, легко рас­познается Т-клетками реципиента. При этом в распознавании Т-клеточным рецептором может участвовать не только пептид, погруженный в мо­лекулу MHC, но также и часть донорской молеку­лы MHC [13].

В непрямом или косвенном пути Т-клетки ре­ципиента распознают чужеродный антиген через собственные АПК, которые презентируют под­вергшиеся катаболизму молекулы MHC донора. В целом косвенный путь похож на нормальный процесс представления бактериального антигена [14].

Полагают, что прямой путь может быть ответ­ствен за развитие острого отторжения, в то время как косвенный путь играет доминирующую роль в процессе хронического отторжения [15].

В реакции клеточного отторжения основ­ное участие принимают два типа клеток CD8 и CD4 Т-клетки. CD4-клетки, так называемые Т-хелперные клетки, считаются наиболее важны­ми в инициации и регуляции отторжения транс­плантата. Независимо от пути распознавания мо­лекулы MHC активированные Т-хелперные клетки делятся и выделяют различные цитокины, которые служат как факторами роста, так и факторами ак­тивации CD8 цитотоксических Т-клеток, В-клеток и макрофагов, которые вызывают разрушение трансплантата [16]. CD8 Т-цитотоксические так­же способны к секреции цитокинов, однако этой секреции без влияния Т-хелперных клеток недо­статочно для запуска отторжения [17]. Основная функция CD8-клеток - прямой лизис клеток до­нора. Активированные макрофаги и Т-хелперные клетки сами по себе способны привести к от­торжению трансплантата через развитие реак­ции гиперчувствительности замедленного типа. В-клетки ответственны за выработку антител, ко­торые, связываясь со своим специфическим анти­геном, принимают участие в развитие гумораль­ного отторжения [18].

В инициации иммунологической реакции, по­мимо взаимодействия Т-клеточного рецептора с молекулой MHC и ее пептидом, принимают уча­стие большой ряд молекул коактивации (рис. 4.) [19]. Полная активация Т-клеток возможна толь­ко при взаимодействии и работе двух отдель­ных, но синергетических сигналов. Первый сиг­нал заключается в том, что поставляемые через Т-клеточный рецептор антигены представляют себя и несут ответственность за специфичность иммунного ответа. Второй, или костимуляторный, сигнал - антигеннеспецифический, однако от него зависит характер направленности им­мунного ответа. Многие Т-клеточные молекулы могут служить в качестве рецепторов для костимуляторных сигналов. Вместе с тем, наибольшее значение имеют молекулы CD28/CTLA-4/B7 [20]. CD28 имеет два известных лиганда B7-1 (CD80) и В7-2 (CD86), оба из которых экспрессирова­ны, прежде всего, на активированных АПК [19]. Помимо этого, Т-клетки также презентируют CTLA-4 (цитотоксический Т - лимфоцитарный антиген), молекулу, структурно схожую с CD28, которая способна связывать B7-1 и В7-2. Однако в отличие от CD28 CTLA-4 передает тормозящий сигнал, который вызывает прекращение иммун­ного ответа [21].

Покоящиеся Т-клетки постоянно экспресси­руют CD28, хотя и в значительно меньшем коли­честве без предварительной стимуляции, в то же время покоящиеся АПК не презентируют молеку­лы B7 [22]. В течение шести часов после актива­ции АПК экспрессируют молекулы B7-2, а через 48-72 ч - молекулу B7-1. Молекулы B7-1 и В7-2 могут связаться как с CD28, обеспечивая актива­цию иммунного ответа, так и с CTLA-4, вызывая тормозной сигнал. CTLA-4, обладая большей авидностью к коактивационным молекулам, свя­зывает молекулы В7 с большим сродством, чем CD28, поэтому при снижении экспрессии молеку­лы CD28 тормозное взаимодействие CTLA-4/B7 в конечном итоге преобладает, что ведет к прекра­щению иммунного ответа [19-22].

Помимо основного пути передачи второго ко- стимуляционного сигнала CD28/B7, существуют и вспомогательные пути, которые реализуются через парное взаимодействие дополнительных молекул на мембранах Т-хелперных лимфоцитов и АПК. При активации костимуляционного пути CD40-CD40L повышается экспрессия молекул B7 на АПК и усиливается выделение провоспалительных цитокинов, которые активируют Т-клетки [23]. Если в качестве АПК выступает В-клетка, то, помимо передачи дополнительного кости- муляционного сигнала на Т-хелпер, активация CD40-CD40L-пути влияет и на сам В-лимфоцит.

В результате такого взаимодействия происходит интенсивный обмен информацией между клетка­ми с последующей стимуляцией АПК, т.е. самого В-лимфоцита [23, 24].

Еще одним путем костимуляции Т- и В-клеток является взаимодействие молекул ICOS (Inducible T-cell COStimulator, CD278) с его лигандом ICOSL. ICOS является гомологом CD28, но экспрессиру­ется только на активированных Т-клетках, в боль­шей мере на T-хелперных клетках 2-го типа. Ли­гандом для ICOS является молекула В7Һ (CD275), структурно схожая с В7, однако, не способная взаимодействовать с CD28 и CTLA-4. Стимуляция Т-клеток по пути ICOS-В7h стимулирует пролифе­рацию клеток и выделение цитокинов. Поскольку ICOS экспрессируется также и В-клетками, акти­вация этого пути передачи сигнала может сопрово­ждаться продукцией антител [25].

Взаимодействие молекул 0X40 (CD 134) и 0X40L (CD252) является важным костимуляци- онным сигналом для Т-клеток, сравнимым по зна­чимости с CD28-B7, и имеет ключевое значение для формирования CD4 аллореактивных клеток памяти. Активация 0X40-0X40L-пути, подобно пути CD40-CD40L, приводит к двунаправленной стимуляции клеток: активации и стимуляции про­лиферации Т-клеток и повышению продукции провоспалительных цитокинов АПК [24].

Сигнальные пути 0X40-0X40L, CD40-CD40L играют важную роль в CD28-B7-независимой ак­тивации Т-клеток. При блокаде этих путей значи­тельно уменьшается степень повреждения алло­трансплантата [26].

При отсутствии костимуляторных сигналов Т-клетки, сталкиваясь с антигеном, подвергают­ся неудачной активации. Они не вырабатывают заметного количества цитокинов и не делятся, а вместо этого перестают отвечать на запросы соот­ветствующей стимуляции на срок до нескольких недель, т.е. возникает анергия [27], или подверга­ются запрограммированной клеточной смерти - апоптозу [19, 23].

Помимо молекулы CTLA-4, тормозящим про­лиферацию и активацию Т-клеток обладает белок PD-1 (CD279), имеющий два лиганда - PD-L1 (B7-H1, CD274) и PD-L1 (B7-DC, CD273). Ак­тивация данного сигнального пути ингибирует пролиферацию и продукцию цитокинов антигенспецифичных CD4- и CD8-клеток. Выраженность ингибирующего действия этих молекул зависит от наличия других костимуляционных сигналов, в частности CD28-87. Блокирование этого сигналь­ного пути ускоряет отторжение ПАТ, введение же PD-L1-Ig тормозит реакцию отторжения [28].

Процессы передачи сигналов молекулярных взаимодействий между АПК и Т-клетками весь­ма многогранны, в зависимости от их результата происходят дальнейшая активация и дифференцировка или анергия и апоптоз Т- и В-лимфоцитов, а также других клеток, участвующих в развитии реакции отторжения ПАТ [19, 23, 24].

Некоторые современные иммуносупрессив- ные препараты направлены на блокирование одного из костимуляционных путей, к примеру, введение CTLA-4Ig (Белатасепт) нарушает взаи­модействие между молекулами B7-CTLA-4, тем самым предотвращая отторжение [29]. Другие препараты воздействуют на внутриклеточные процессы активации Т-клеток. Ингибиторы кальцинейрина (такролимус, циклоспорин) прерыва­ют дефосфорилирование NFAT (ядерного фактора активированных Т-клеток), благодаря чему NFAT не перемещается из цитоплазмы в ядро и не про­исходит синтез провоспалительных цитокинов, в частности ИЛ-2 [30].

Применяемые в настоящее время иммуноде­прессанты обладают исключительно мощным, блокирующим отторжение действием, однако не один из них не является антигенспецифическим [31]. Именно поэтому при тотальной иммунсупрессии снижается устойчивость к инфекциям.

Иммунологическая толерантность

Иммунологическая толерантность - состоя­ние ареактивности в отношение того или иного антигена, которое возникает в результате предше­ствующего контакта с этим антигеном [32]. Ак­тивно функционирующие механизмы толерант­ности жизненно необходимы в процессе развития организма, так как они предотвращают развитие иммунных реакций против собственных антиге­нов и многих других безвредных антигенов, по­падающих в организм с воздухом, пищей и т.д. Достичь поставленной цели помогают механизмы центральной и периферической толерантности (рис. 5) [31-33].

В тимусе происходит формирование Т-клеток из клеток-предшественников с еще неперестро­енными генами Т-клеточных рецепторов. В про­цессе развития лимфоцитов в тимусе эти гены подвергаются перестройке, после чего Т-клетки начинают экспрессировать Т-клеточный рецептор (ТкР), способный распознавать пептиды в связы­вающей их полости молекул MHC на АПК. На этапе созревания лимфоцитов в тимусе образу­ются большое количество Т-клеток с дефектным ТкР, обладающим аутореактивными свойствами. Такие клетки подвергаются отрицательной селек­ции и, в конечном счете, погибают в результате запуска различных механизмов апоптоза [34, 35].

Процесс отрицательной селекции в тимусе несовершенен, поэтому часть аутореактивных Т-клеток все же попадают в пул периферических лимфоцитов. Предотвращение развития аутоим­мунных реакций поддерживается механизмами периферической, или посттимической, толерант­ности. Активно функционирующими механизма­ми формирования периферической толерантности Т-клеток являются клональная делеция, анергия и супрессия [36].

Клетки могут стать неотвечающими, полу­чив опосредованный ТкР-сигнал. Подавление их функции может происходить в результате сниже­нии экспрессии ТкР и корецепторных молекул [24]. Аннергия Т-лимфоцитов легко демонстри­руется в опытах invitro и invivo на некоторых животных моделях [37, 38]. Стимулирование ТкР в отсутствие костимуляционных сигналов приво­дит к анергии Т-лимфоцитов, однако стоит устра­нить это отсутствие, например, при стимулирова­нии Т-клеток посредством ИЛ-2 развивается им­мунная реакция [39].

Для поддержания толерантности к собствен­ным антигенам и гомеостаза иммунной системы имеет значение клональная делеция Т-клеток вне тимуса, когда после активации антигеном большинство аутореактивных клеток погибают в результате апоптоза. Этот механизм служит для контроля аутоиммунных реакций и поддержа­ния должного пула лимфоидных клеток. Процесс инициации клональной делеции запускается раз­личными путями. Взаимодействие рецептора Fas (CD95) с его лигандом FasL запускает последую­щую цепь передачи сигналов, которая активирует ИЛ-1β-конвертирующие ферментоподобные протеазы, вызывающие апоптоз [40]. Молекула FasL может как экспрессироваться на активированных Т-клетках, обуславливая непосредственное меж­клеточное взаимодействие по принципу «братоу­бийства», так и находиться в растворимой форме, запуская аутокринный механизм апоптоза (рис. 6). Рецептор PD-1 имеет два лиганда PD-L1 и PD-L2, при его активации запускается двойной механизм стимулирования апаптоза, с одной стороны, вы­зывая гибель Т-эффекторных клеток, с другой - ингибирование апоптоза Т-супрессорных клеток [41]. Молекула CTLA-4 также играет важную роль как отрицательный регулятор, в результате чего ее взаимодействие с молекулой B7 на поверхности АПК может прервать клеточный цикл деления Т-клетки и вызвать ее гибель или анергию [42].

Доказательства существования специфических супрессорных или толерогенных клеток были не­однократно показаны в экспериментальных ра­ботах по адаптивному переносу, когда индукции толерантности у интактных животных удавалось добиться, вводя им клетки толерантных живот­ных [43, 44]. Одно из предложенных объяснений для данной формы толерантности предполагает существование двух популяций Т-лимфоцитов, продуцирующих различные цитокины. Известно, что многие воспалительные аутоиммунные реак­ции индуцируются Т-хелперными клетками 1-го типа (Тх1-клетки), продуцирующими такие про- воспалительные цитокины, как ИЛ-2, ИФН-γ и ФНО. Цитокины, продуцируемые Т-хелперными клетками 2-го типа (Тх2-клетки), ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-9 и ИЛ-10-поддерживают антителообразование, однако, наряду с этим, подавляют эффекторные функции макрофагов, включая их презентацию антигена Тх1-лимфоцитам и нести- мулированным Т-клеткам. Активно изучаются молекулярный фенотип супрессорных клеток, их поверхностные маркеры и продуцируемые ими растворимые факторы. Регуляторные Т-клетки (Tregs) - это субпопуляции Т-хелперных клеток (CD3+CD4+), которые экспрессируют большое количество молекул CD25(hi) и фактор транс­крипции Foxp3 и играют важную роль в подавле­нии аутоиммунных реакций [45]. Существуют предположения, что данная популяция клеток мо­жет иметь место в формировании трансплантаци­онной толерантности [46].

Индукция толерантности аутореактивных В-клеток к собственным антигенам также может происходить через механизмы их делеции или анергии. Это зависит от аффинности антигенных рецепторов В-клеток и природы соответствующе­го антигена, в частности от того, является ли он интегральным белком клеточной мембраны или представляет растворимый, циркулирующий, в основном мономерный белок. Особое значение в управлении В-клеточного иммунного ответа игра­ет роль клеток Тх2 типа [47].

Физиологические механизмы толерантности ученые пытались воспроизвести в трансплан­тации органов и тканей между гомологичными особями одного вида. Некоторого успеха удалось добиться при одновременной пересадке почки и костного мозга у иммунокомпрометированных больных, формируя клеточный химеризм [48, 49].

Существуют различные методы, направленные на изоляцию Tregs и их использование в формирова­нии иммунологической толерантности при транс­плантации солидных органов [50, 51]. Полагают, что формирование толерантности возможно до­стичь путем истощения Т-клеточной популяции, подобно формированию устойчивости к хрони­ческому вирусному заражению, однако данное предположение остается спорным [52, 53]. Одним из методов эффективной борьбы с отторжением трансплантата и формированием частичной им­мунологической толерантности является экстра­корпоральная фотохимотерапия или фотоферез [54, 55].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Расширение знаний о трансплантационной им­мунологии способствует углубленному понима­нию механизмов развития отторжения почечного аллотрансплантата. В трансплантации иммуноло­гический конфликт обусловлен чужеродностью тканей, его антигенностью, наибольшее значе­ние в котором играет различие в строении моле­кул MHC донора и реципиента. Для инициации иммунного ответа необходимо взаимодействие Т-клеточного рецептора с антигенным пептидом, погруженным в MHC. Помимо этого, для развития иммунного ответа необходима передача допол­нительного сигнала с молекул коактивации, в за­висимости от его результата происходят дальней­шая активация и дифференцировка или анергия и апоптоз Т- и В-лимфоцитов, а также других кле­ток, участвующих в развитии реакции отторже­ния. Процессы иммунологической толерантности тесно связаны с корецепторным взаимодействием, особое значение в котором приобретают супрес­сорные или толерогенные клетки, относящиеся к клеткам Т-хелперной субпопуляции (CD3+ CD4+), экспрессирующие большое количество молекул CD25(hi) и фактор транскрипции Foxp3.

Формирование иммунологической толерантно­сти, при котором, возможно, будет избирательное отсутствие иммунного ответа к антигенам переса­женного органа, является весьма перспективным направлением в трансплантологии. Такая таргетная терапия позволит избежать губительного воз­действия тотальной иммуносупрессии и улучшить результаты трансплантации почки и длительность жизни почечного аллотрансплантата.