ПРОТОКОЛЬНАЯ БИОПСИЯ ПОЧЕЧНОГО АЛЛОТРАНСПЛАНТАТА КАК КРИТЕРИЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЙ ФОТОХИМИОТЕРАПИИ

ВВЕДЕНИЕ

Частота развития острого отторжения почеч­ного аллотрансплантата (ПАТ) остается весьма значительной и составляет по нашим данным от 23,1 до 32,5%, некупируемые кризы отторжения почечного аллотрансплантата составляют от 3,2 до 12,4% [1]. Почти 50% всех неудач в процес­се трансплантации обусловлены отторжением, и большая часть реципиентов трупной почки име­ют, по крайней мере, один эпизод острого оттор­жения в течение первых 2 лет после аллотран­сплантации трупной почки (АТТП) [2]. Известно, что немедленная функция трансплантата и отсут­ствие острой реакции отторжения в первые 6 мес после трансплантации почки практически в 2 раза увеличивают период полужизни ПАТ [3]. Патоге­нетической основой острого отторжения является повреждение ПАТ, обусловленное клеточным и/ или гуморальным аллоиммунным механизмом с лимфоцитарной, моноцитарной и нейтрофильной инфильтрацией интерстиция. Морфологическими признаками являются гломерулит, капиллярит и тубулит. При этом у 80% пациентов отторжение происходит с привлечением гуморальных меха­низмов, причем у 65% пациентов имеет место со­четание гуморального и клеточного механизмов [4].

В том, что эпизоды острого отторжения транс­плантата неблагоприятно влияют на результаты ТП, сходятся все исследователи. Пяти- и десяти­летняя выживаемость ПАТ составляет 75 и 17% в группе больных, перенесших кризы отторжения, а в группе больных без кризов - 93 и 87% соответ­ственно. Кризы отторжения способствуют разви­тию активного хронического отторжения и фор­мированию хронической дисфункции ПАТ [5-7].

В этой связи дальнейшая разработка и внедре­ние в клиническую практику новых иммуномоду­лирующих методик остаются в настоящее время главной стратегией предупреждения и лечения острого отторжения и продления жизни транс­плантата [8-10].

Нами исследован новый адоптивный (от англ. adoptive - в данном контексте - восприимчи­вый) метод предупреждения и лечения острого отторжения почечного трансплантата - экстра­корпоральная фотохимиотерапия (ЭФХТ). В его основе лежит воздействие активированных уль­трафиолетовым светом молекул специфического фотосенсибилизатора на лимфоциты крови. Эф­фективность ЭФХТ была доказана на основании проведения многоцентровых исследований при различных вариантах аутоиммунных дерматозов [11-14], при реакции трансплантат против хозяи­на при трансплантации аллогенных стволовых гемопоэтических клеток у больных с гемобластозами [15-17], в том числе у детей [18], и при трансплантации сердца, легких и печени [19-22].

Известны результаты нескольких исследова­ний с участием в общей сложности до 50 паци­ентов после аллотрансплантации трупной почки, где курсы ЭФХТ были с успехом использованы для купирования устойчивых эпизодов острого отторжения [23-29]. При этом авторы пришли к заключению, что ЭФХТ может иметь значение в качестве адъювантной терапии или как метод вы­бора для предотвращения отторжения при пере­садке солидного органа [27]. Имеются также еди­ничные публикации о применении данного мето­да в качестве профилактики острого отторжения почечного аллотрансплантата [30, 31].

Помимо признанного клинического преиму­щества экстракорпоральной фотохимиотерапии, необходимым является предоставление гисто­логических доказательств эффективности ме­тода. На 11-й Банфф - конференции в 2011 году, посвященной актуальным вопросам патологии аллотрансплантатов солидных органов, широ­ко обсуждалась роль протокольных биопсий в трансплантологии. Большое внимание коллектив доктора D. Seron уделил установлению прогно­стического значения субклинических изменений в трансплантате, поскольку, по имеющимся дан­ным, частота субклинического острого отторже­ния составляет 60,8; 45,7; 25,8 и 17,7% через 1, 3, 12 и более 12 мес после трансплантации соот­ветственно [32].

Целью исследования является сравнительное проспективное изучение гистологических резуль­татов протокольной биопсии почечного аллотран­сплантата при включении в протокол медикамен­тозной иммуносупрессивной терапии метода экс­тракорпоральной фотохимиотерапии в качестве профилактики острого отторжения трансплантата и терапии возвратного гломерулонефрита.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В число пациентов основной (первой) группы (n=20) вошли 12 мужчин в возрасте от 31 года до 56 лет и 8 женщин в возрасте от 27 до 50 лет (40,4±11,2), которые получали стандартную ме­дикаментозную иммуносупрессивную терапию в сочетании с экстракорпоральной фотохимиотера­пией. Группу сравнения (вторую) (n=20) состави­ли 12 мужчин в возрасте от 21 года до 55 лет и 8 женщин в возрасте от 37 до 48 лет (39,1±12,1), ко­торые являлись реципиентами парных основной группе трансплантатов и получали только обще­принятую медикаментозную иммуносупрессию. Процедуры экстракорпоральной фотохимиотера­пии в качестве терапии возвратного гломерулонефрита получал 1 мужчина в возрасте 38 лет.

Причинами ХБП у реципиентов почечных ал­лотрансплантатов в двух группах больных яви­лись практически идентичные заболевания: хро­нический гломерулонефрит (у 19), поликистоз по­чек (у 9), артериолосклеротичский нефросклероз (у 4), хронический пиелонефрит (у 7). У 1 больно­го группы сравнения диагностирован антифосфо- липидный синдром. Длительность заместитель­ной почечной терапии перед трансплантацией у пациентов первой группы составила, в среднем, 23,2 ± 8,2 мес, в группе сравнения - 24,6 ± 7,4 мес. Индекс совместимости в двух группах ока­зался сопоставим и составил 9 (5;13) и 8 (4;13) в основной и контрольной группах соответственно. Рандомизация пациентов осуществлялась мето­дом слепой случайной выборки.

Процедуры ЭФХТ проводились пациентам первой группы в первые 2 нед после трансплан­тации почки с кратностью 2 раза в неделю, в по­следующие 2 нед - 1 раз в неделю, в течение 2-го месяца - 1 раз в 2 нед, 1 раз в течение 3-го месяца и завершались одной процедурой на 180-е сутки после трансплантации почки. Пациенту с целью терапии фокального и сегментарного гломеруло- склероза проведено 7 сеансов с кратностью 2-3 раза в неделю.

В качестве фотосенсибилизатора использовали Аммифурин в дозе 0,6 мг/кг массы тела, который принимал пациент за 2 ч до проведения процеду­ры. Методика ЭФХТ заключалась в сепарации и накоплении в экстракорпоральном контуре мононуклеарных клеток с помощью аппарата для цитоплазмафереза «MSC+ «Heamonetics» с последующим их облучением ультрафиолетовым светом (А-спектр 365 нм) в течение 90 мин со скоростью 10 мл/мин. Далее клетки подвергались инкубации в течение 90 мин при температуре 37°С, после чего проводилась реинфузия клеток пациенту.

Протокольное морфологическое исследование биоптатов трансплантированных почек проводи­лось на 30-е и 180-е сутки после аллотрансплан­тации или при наличии показаний в ГБУЗ «Город­ская клиническая больница №52 Департамента здравоохранения г. Москвы», Московский город­ской нефрологический центр (Е.С. Столяревич). Гистологическое исследование биоптатов транс­плантата почки включало в себя световую микро­скопию и иммунофлюоресцентное исследование на замороженных срезах. При проведении све­товой микроскопии проводили окраску гематок­силином и эозином, ШИК-реакцию и окраску трихромом по Массону. Морфологическую диа­гностику проводили в соответствии с классифи­кацией острого отторжения трансплантата Banff 2007 [33]. Морфолог не имел информации о том, к какой группе относится пациент.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Необходимо отметить, что все пациенты пер­вой группы выписаны после аллотрансплантации трупной почки в удовлетворительном состоянии с достаточным диурезом и средним уровнем сы­вороточного креатинина 0,15±0,02 ммоль/л, со­хранили удовлетворительную функцию почеч­ного аллотрансплантата до 6 мес после АТТП со средней скоростью клубочковой фильтрации 59,7±3,2 мл/мин против 31,5±4,1 мл/мин в кон­трольной группе (р<0,05). Анализ клинических и лабораторных данных позволяет выявить незна­чительно более раннее восстановление функции почечного трансплантата в основной группе, о чем свидетельствуют меньшая продолжитель­ность олигоанурии (5,3±1,1 против 7,8±1,2 сут), более уверенные темпы снижения цифр азотемии (23±3,1 против 26,4±4,2 сут) и меньшая длитель­ность проведения заместительной почечной те­рапии (10,6±1,2 против 14,6±2,4 сут) у пациентов группы с применением ЭФХТ.

По данным гистологического исследования биоптатов почечных аллотрансплантатов морфо­логические изменения, характерные для остаточ­ных явлений ишемического и реперфузионного повреждения трансплантата, были выявлены у 12 реципиентов основной группы и у 3 реципи­ентов контрольной: гиалиново-капельная и гидропическая дистрофия эпителия проксимальных извитых канальцев, единичные очаги некроза эпителия канальцев, признаки регенеративного процесса канальцах (наличие митозов в эпители­альных клетках), расширение просвета канальцев с белковыми цилиндрами и десквамированными эпителиальными клетками в их просвете, а также минимальная мононуклеарная инфильтрация интерстиция (i1).

У одного пациента группы сравнения через 6 мес после АТТП при биопсии диагностирован фокальный сегментарный гломерулосклероз, а еще у троих - хроническая трансплантационная нефропатия III степени: выраженный склероз интерстиция и атрофия канальцев, склероз клубоч­ков (ci 3, ct 2-3, cg 2).

Ни у одного пациента основной группы не было выявлено признаков острого отторжения трансплантата. Изменения, обнаруженные в трансплантате через 1 мес после операции, со­ответствовали остаточным явлениям острого ка­нальцевого некроза, а через 6 мес - начальным проявлениям хронической трансплантационной нефропатии: ci 1-2, ct 1, cg 1.

У 4 реципиентов пациентов группы сравнения было диагностировано острое отторжение транс­плантата, подтвержденное морфологическим ис­следованием биоптатов. У троих реципиентов группы сравнения криз отторжения диагностиро­ван при протокольной биопсии через 1 мес после АТП, а у одного реципиента - через 6 мес после операции (табл. 1).

В первом случае отторжению ПАТ присвоена IA категория согласно Banff07 (рис. 1А). Поми­мо явлений клеточного интерстициального оттор­жения (i2—3, t2, v0), отмечались также признаки микроциркуляторного воспаления (перитубуляррит), однако свечение C4d на перитубулярных капиллярах отсутствовало. При этом отторжение имело субклиническое течение и не сопровожда­лось яркой клинической симптоматикой. Этому пациенту группы сравнения проведена пульс-те­рапия метилпреднизолоном. При контрольной би­опсии трансплантата изменения соответствовали остаточным явлениям острого отторжения и хро­нической трансплантационной нефропатии II сте­пени, а на 180-е сутки после АТТП — хронической трансплантационной нефропатии III степени.

При исследовании биоптата парной почки (у реципиента основной группы) обнаружена лишь небольшая очаговая инфильтрация интерстиция лимфоцитами без явлений тубулита (i1, t0), име­лись также незначительные признаки острого по­вреждения канальцевого эпителия (см. рис. 1Б).

Сосудистая форма острой реакции отторжения имела место у одного из пациентов группы срав­нения (III категория по классификации Banff07). У этого больного отторжение сопровождалось яркой клинической симптоматикой: резкие боли в области трансплантата, повышение температу­ры тела, при пальпации — плотный, увеличенный в размерах трансплантат, в анализе крови —лей­коцитоз, который имел тенденцию к нарастанию (13, затем 15*10⁹/л). Помимо этого, отмечено снижение гемоглобина с 110 до 75 г/л. В связи с подозрением на разрыв трансплантата выполнена экстренная ревизия забрюшинного пространства, в ходе которой обнаружены линейные разрывы капсулы трансплантата, паранефральная гематома объемом до 300 мл и обширная имбибиция забрюшинной клетчатки. Произведены эвакуация гема­томы, ушивание линейных разрывов транспланта­та. Интраоперационно выполнена биопсия ПАТ. Биопсийный материал был представлен практи­чески полностью разрушенной тканью почки, не­которые клубочки склерозированы, а оставшиеся выглядели гиперклеточными за счет явлений гломерулита. В одном клубочке капиллярные петли частично разрушены, окружены сегментарным клеточным полулунием, еще в двух клубочках определяются более старые фиброзно-клеточные полулуния. Отмечалась также диффузная ин­фильтрация интерстиция лимфоцитами с приме­сью нейтрофилов, многие канальцы полностью разрушены. В участках относительно сохранной паренхимы - тяжелое повреждение канальцевого эпителия, явления тубулита до 6-8 клеток на срез канальца. В просвете канальцев многочисленные воспалительные клетки и слущенные клетки ка­нальцевого эпителия. Перитубулярные капилляры резко расширены, содержат стазы крови. Артерии с трансмуральным артериитом (рис. 2) расшире­ны, содержат стазы крови. Артерии с трансму­ральным артериитом (см. рис. 2А, Б).

Этому пациенту назначена терапия антити- моцитарным глобулином в дозе 4 мг/кг (введено 300 мг препарата). На следующий день у больного появились признаки пневмонии: жалобы на мало­продуктивный кашель, подъем температуры тела до 37,8 °С, одышка при минимальной физической нагрузке, при аускультации жесткое дыхание и сухие хрипы в базальных отделах правого легко­го. Диагноз был подтвержден рентгенологически. От дальнейшего введения препарата пришлось отказаться. В дальнейшем на фоне пульс-терапии метилпреднизолоном в суммарной дозе 1,5 г за неделю этому больному группы сравнения про­ведено 4 сеанса каскадной плазмофильтрации, после которых внутривенно вводился иммуногло­булин. Назначена антимикробная, противогриб­ковая и противовирусная терапия, на фоне чего явления пневмонии были купированы. Пациент был выписан в удовлетворительном состоянии на 53-и сутки после АТП, креатинин крови составил 100 мкмоль/л.

Однако через полгода пациент был вновь го­спитализирован в связи с тяжелой дисфункцией трансплантата: креатинин крови - 1100 мкмоль/л, мочевина - 52 ммоль/л, суточная протеинурия - 32 г/сут, скорость клубочковой фильтрации со­ставила до 6 мл/мин. По данным биопсии ПАТ был диагностирован фокальный сегментарный гломерулосклероз (коллабирующий вариант): спавшиеся капиллярные петли 2 из 7 клубочков, окруженные гипертрофированными подоцитами с вакуолизированной цитоплазмой, в двух клу­бочках - ишемия капиллярных петель. Отмече­ны небольшой очаговый склероз интерстиция и атрофия канальцев, занимающие около 10-15% площади паренхимы, с сопутствующей интерсти­циальной инфильтрацией без явлений тубулита, артериосклероз. Были проведены пульс-терапия метилпреднизолоном в суммарной дозе 2,25 г, 4 сеанса плазмафереза. Однако терапия была не­эффективна. В связи с тяжелым нефротическим синдромом была выполнена трансплантатэктомия и сформирована артериовенозная фистула, после чего больной вернулся на гемодиализ.

На протокольной биопсии парного трансплан­тата на 30-е сутки у больного основной группы выявлены небольшой очаговый склероз интерстиция и атрофия канальцев, занимающие менее 5% почечной паренхимы, умеренная очаговая ин­фильтрация интерстиция лимфоцитами без явле­ний тубулита. В отдельных канальцах отмечалось расширение просвета, в других канальцах - ча­стичная утрата «щеточной каймы» с образовани­ем фестончатого контура канальцевого эпителия. Имеются канальцы с явлениями регенерации и образованием многорядного эпителия. Данные изменения соответствовали остаточным явлениям острого канальцевого некроза (см. рис. 2В).

На протокольной биопсии трансплантата на 180-е сутки после трансплантации отмечены диффузно-очаговый склероз интерстиция и атро­фия канальцев, занимающие около 25-30% па­ренхимы почки, что соответствует хронической трансплантационной нефропатии II степени.

У третьего реципиента группы сравнения с кризом отторжения в раннем послеопераци­онном периоде отсутствовала функция ПАТ на протяжении двух недель. При этом в анализах крови сохранялись лейкоцитоз до 14*10⁹/л, отек трансплантата, обедненный сосудистый рисунок, стабильно повышенный индекс резистивности, отсутствие диастолического кровотока в сосудах трансплантата по данным допплерографии. Про­ведены пульс-терапия метилпреднизолоном в об­щей дозе 1,5 г, 4 сеанса каскадной плазмафильтрации с внутривенным введением иммуноглобу­лина. Несмотря на проводимую терапию, функ­ция трансплантата не восстановилась, в связи с чем была выполнена биопсия, по результатам ко­торой диагностировано острое отторжение ПАТ (Banff07 IIB) по смешанному типу (клеточное и гуморальное). При гистологическом исследова­нии трансплантата - картина микроциркуляторного воспаления (гломерулит с преобладпнием нейтрофилов) с элементами тромботической микроангиопатии (тромбоз приносящей артериолы одного из клубочков) и участками ишемического инфаркта почки, а также признаки тяжелого интимального артериита с выраженным сужением просвета. По данным иммунофлюоресценции - свечение C4d-компонента комплемента в капил­лярах клубочков и перитубулярных капиллярах (рис. 3А).

Назначена терапия ритуксимабом, однако, функция трансплантата не восстановилась, и трансплантат был удален.

У реципиента основной группы, получивше­го парный орган, при проведении протокольной биопсии трансплантата на 30-е сутки изменения соответствовали остаточным явлениям острого канальцевого некроза (см. рис. 3Б).

Четвертый случай криза отторжения у реци­пиента группы сравнения был выявлен случайно, при протокольной биопсии через полгода после АТТП, по данным которой было диагностирова­но острое отторжение ПАТ (Banff07 IB) на фоне хронической трансплантационной нефропатии II— III степени (рис. 4А). Пациенту проведена пульстерапия метилпреднизолоном в общей дозе 1,5 г. При контрольной биопсии после курса лечения признаки отторжения отсутствовали. Функция ПАТ восстановилась.

У парного реципиента основной группы в биоптате на 180-е сутки после АТТП выявлена хроническая трансплантационная нефропатия I степени: умеренный очаговый интерстициаль­ный склероз, занимающий около 20% паренхимы почки, очаговая интерстициальная инфильтрация в зонах склероза без явлений тубулита (см. рис. 4Б).

Клинический пример терапии возвратного гломерулонефрита у пациента после транс­плантации почки.

Пациент через 1 год после АТТП на амбула­торном приеме отметил повышение АД, прибавку массы тела на 3 кг, отеки голеней, стоп. Лабора­торно выявлена протеинурия до 12 г/сут, повы­шение уровня сывороточного креатинина до 0,23 ммоль/л и мочевины до 17,9 ммоль/л, снижение СКФ до 33,8 мл/мин. Пациент был госпитализи­рован, сделана биопсия. По результатам: в препа­рате 13 клубочков, в одном из них капиллярные петли коллабированы, окружены гипертрофи­рованными подоцитами. Еще в двух клубочках определяются участки сегментарного склероза капиллярных петель с пенистыми клетками в этих участках и образованием сращений с капсулой Боумена. Оставшиеся клубочки увеличены в раз­мерах, пролиферативных изменений нет. Стенки капиллярных петель не утолщены, одноконтур­ные. Очаговый фиброз интерстиция и атрофия канальцев, занимающие около 10% почечной па­ренхимы. Интерстициальная инфильтрация прак­тически отсутствует. Артерии и артериолы — без особенностей. Заключение: гломерулонефрит трансплантата (фокальный и сегментарный гло­мерулосклероз).

Проводилась пульс-терапия метилпреднизоло- ном в суммарной дозе 2 г. Проведен 1 сеанс плазмафереза, после которого усилилась протеинурия (до 15 г/сут), появилась гипопротеинемия (альбу­мин 22 г/л). В связи с отсутствием положительно­го эффекта принято решение провести курс ЭФХТ по стандартному протоколу 2 раза в неделю.

На фоне проведенной терапии отмечена поло­жительная динамика: суточная протеинурия по­сле 4 сеансов составила 12 г/сут, отмечено сниже­ние креатинина крови до 0,15 ммоль/л, мочевины до 13,4 ммоль/л, улучшение кровотока до коры почки по данным УЗИ, индексы сопротивления — в пределах нормальных значений. Пациент выпи­сан на амбулаторное наблюдение, однако при ди­намическом наблюдении сохранялись умеренные отеки ног, артериальная гипертензия до 160/90 мм рт. ст., суточная протеинурия колебалась око­ло значения 8 г/сут. В связи с недостаточно вы­раженным эффектом решено продолжить лечение ЭФХТ и пациенту проведено еще 4 сеанса в тече­ние 2 нед. По окончании лечения суточная про- теинурия снизилась до 5 г/сут, нормализовались цифры азотемии (креатинин 0,12 ммоль/л, моче­вина 10,4 ммоль/л, СКФ 61,8 мл/мин), параллель­но стабилизировалось АД и к моменту выписки не требовало коррекции гипотензивными пре­паратами, пропали пастозность голеней и стоп. Динамика снижения показателей уремии, протеинурии и нормализации скорости клубочковой фильтрации на фоне проведения процедур ЭФХТ представлена на рис. 5.

Через 6 мес после лечения выполнена кон­трольная биопсия трансплантата, выявившая гломерулонефрит трансплантата (фокальный и сегментарный гломерулосклероз) без признаков прогрессирования (рис. 6).

Через 4 года после АТТП состояние пациен­та остается удовлетворительным. АД не выше 140/90 мм рт. ст., отеков не отмечается, креатинин крови — 0,09 ммоль/л, мочевина — 10 ммоль/л, СКФ — 80,5 мл/мин, суточная протеинурия — 0,69 г/сут.

Таким образом, показано, что ЭФХТ способна привести к нормализации функции трансплантата без прогрессирования возвратного гломерулонефрита.

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные гистологические результаты про­токольной биопсии ПАТ на 30-е и 180-е сутки после АТТП не оставляют сомнения в преимуще­стве включения метода ЭФХТ в общепринятый медикаментозный протокол иммуносупрессивной терапии для предупреждения острого отторжения почечного аллотрансплантата в ранние сроки по­сле операции, что подтверждено полным отсут­ствием эпизодов острого отторжения в группе с применением ЭФХТ с одновременным наличием их в трансплантатах, парных исследуемой группе.

Полученные результаты применения метода в качестве терапии возвратного гломерулонефрита позволяют охарактеризовать ЭФХТ как метод, способный предотвратить прогрессирование при­знаков фокального и сегментарного гломеруло- склероза и стабилизировать функцию трансплан­тата без применения дополнительной медикамен­тозной иммуносупрессивной терапии.

Однако, если иммунологические механизмы предотвращения отторжения трансплантата мето­дом ЭФХТ уже немного изучены [34, 35], вместе с тем остается не совсем ясным механизм действия ЭФХТ при лечении возвратного гломерулонеф- рита, подобных случаев не встречается ни в зару­бежных, ни в отечественных публикациях.

И наконец, наиболее важным выводом про­веденного исследования является необходимость отметить, что протокольная биопсия способна не только показать значимые отличия в ткани пере­саженной почки между исследуемыми, но также и помогает предотвратить субклинические изме­нения в трансплантате и способствует, таким об­разом, раннему выявлению патологии почечного трансплантата [4, 6, 36, 37].