РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА И ФОЛАТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У ДЕТЕЙ С ОСТРЫМ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТОМ

ВВЕДЕНИЕ

Наиболее значимыми среди наследственных механизмов, повышающих риск тромбозов, яв­ляется наличие тромбогенных полиморфизмов системы гемостаза. Известно, что носительство полиморфизмов генов фолатного цикла сопро­вождается повышением уровня гомоцистеина в крови, в сочетании с полиморфизмом гена инги­битора активатора плазминогена - играет важную роль в развитии микротромбоваскулитов [10-15]. Актуальность проблемы обусловлена возникно­вением тромбозов в большинстве случаев при со­четании факторов воспаления и наличия тромбофилий, что в свою очередь влияет на активность гломерулонефрита [1-9].

Цель работы: изучить частоту встречаемости протромботических полиморфизмов, состояние системы гемостаза у детей с острым гломерулонефритом.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследование включен 31 ребенок в возрас­те от 2 до 15 лет с острым гломерулонефритом, сформированы 2 группы. В 1-ю группу вошли 20 (64,5%) больных с гормоночувствительным не­фротическим синдромом (НС); во 2-ю 11 (35,5%) детей с острым постинфекционным гломерулонефритом (острый ГН), характеризующимся не­фритическим синдромом. Для суждения о нор­мальном распределении в популяции генотипов генов системы гемостаза и генов фолатного цикла обследовано 115 здоровых детей со сходными де­мографическими характеристиками. Контроль­ную группу для сравнения лабораторных данных составили 30 практически здоровых детей.

Определение аллельных вариантов генов осу­ществлялось методом полимеразной цепной ре­акции в режиме реального времени (Real-Time PCR) с использованием конкурирующих Tag- Man зондов. Проведено генетическое исследо­вание шести протромботических полиморфных маркёров генов-кандидатов системы гемостаза: фактора II протромбина (G20210A); фактора V Лейден (G1691A); фактора VII свертывания кро­ви (G10976A); фактора XIII свертывания крови (G226A); фибриногена G(-455)A; ингибитора ак­тиватора плазминогена PAI-1 4G(-675)5G и четы­рех полиморфных вариантов генов, ассоцииро­ванных с нарушениями фолатного цикла: метилентетрагидрофолатредуктазы - (MTHFR С677Т, и MTHFR А1298С), В₁₂-зависимой метионинсинтазы - (MTR A2756G) и метионин-синтазы редуктазы - (MTRR A66G). При анализе часто­ты встречаемости тромбогенных аллельных по­лиморфизмов в исследованной выборке детей с острым гломерулонефритом не было обнаружено гетерозиготных и гомозиготных (минорных алле­лей) полиморфных вариантов гена FII G20210A и гена FV G1691A свертывающей системы крови, что не позволило включить данные генотипы в статистическую обработку и провести соответ­ствующие расчеты.

У больных исследовали показатели системы гемостаза: подсчет количества тромбоцитов в крови, активированное парциальное тромбопла- стиновое время (АПТВ), концентрацию фибрино­гена в плазме, РФМК с помощью количественно­го орто-фенантролинового теста (ОФТ), исследо­вание уровня гомоцистеина крови (ГЦ).

Статистический анализ проводили при помо­щи пакета прикладных программ StatSoft Statistica 6.1 (лицензионное соглашение BXXR006D- 092218FAN11). Для оценки нормальности эмпи­рических распределений использовался критерий Колмогорова-Смирнова, критическая величина уровня значимости принята равной 0,05. Анализ полученных данных осуществляли методами ва­риационной статистики с вычислением средних величин (M), показателя достоверности различий при сравнении между группами (р). Распределе­ние значений количественных показателей оцени­вали с помощью критерия Шапиро-Уилка. В рас­четах использовали φ - угловое преобразование Фишера, критерии оценки значимости различия срединных величин по t-критерию Стьюдента и χ² - критерий Пирсона. Различие сравниваемых величин считали статистически значимыми при p<0,05, используя при этом онлайн калькуля­тор (http://www.oege.org/software/hardy-weiberg.shtml).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Среди 31 пациента с острым гломерулонефритом у 20 диагностирован гормоночувствительный нефротический синдром; у 11 - нефритический синдром.

Характеристика 1-ой группы пациентов с гор­моночувствительным нефротическим синдромом. У 20 больных дебют заболевания характеризовал­ся симптомокомлексом нефротического синдрома (НС) без артериальной гипертензии, гематурии и нарушения функции почек. В исследование были включены 13 мальчиков и 7 девочек в возрасте 2-15 лет (средний возраст 7,9±2,2). Пациенты с не­фротическим синдромом получали преднизолон в дозе 2мг/кг/сут 4-6 недель с постепенным сни­жением дозы с переходом на поддерживающую. Общий курс составил 12-14 недель. Нормализация анализов мочи у детей в среднем отмечалось на второй неделе назначения преднизолона.

В ходе исследования пациентов с нефротиче­ским синдромом были рассчитаны частоты алле­лей изученных полиморфных вариантов генов си­стемы гемостаза и фолатного цикла (табл. 1).

При сравнении распределения частоты алле­лей генов системы гемостаза и фолатного мета­болизма у больных детей с нефротическим син­дромом и контрольной группы получено, что ма­жорный аллель 5G (-675) гена PAI-1 значимо чаще выявлен в группе больных пациентов (р=0,042) по сравнению с контролем. По остальным часто­там аллелей в исследованных полиморфных вари­антах генов статистически значимых различий не наблюдалось.

Распределение частот аллелей и генотипов в изученных генах системы гемостаза и фолатного метаболизма у детей с нефротическим синдромом соответствует равновесию Харди-Вайнберга.

У детей с нефротическим синдромом гетеро­зиготный генотип 677 СТ гена MTHFR и гетеро­зиготный генотип 66 АG гена MTRR встречались с большей частотой, чем в группе контроля.

Характеристика 2-ой группы с острым ГН не­фритическим синдромом у детей. Проведено ис­следование полиморфных вариантов генов систе­мы гемостаза и фолатного метаболизма у 11 детей с острым постинфекционным гломерулонефри­том (острый ГН), характеризующимся нефрити­ческим синдромом. В исследование были включе­ны 9 мальчиков и 2 девочки в возрасте 2-15 лет (средний возраст (8,2±1,9).

В ходе обследования пациентов с острым ГН нефритическим синдромом были рассчитаны ча­стоты аллелей изученных полиморфных вариан­тов генов системы гемостаза и фолатного метабо­лизма табл. 3.

При сравнении распределения частоты алле­лей генов системы гемостаза и фолатного мета­болизма у больных с острым ГН нефритическим синдромом и контрольной группы статисти­чески значимых различий выявить не удалось (р>0,05).

Обнаружено, что распределение частот гено­типов генов факторов свертывания крови и генов фолатного метаболизма соответствует равнове­сию Харди-Вайнберга.

При сравнении распределения частоты алле­лей, генотипов генов системы гемостаза и фолатного метаболизма у больных с острым ГН не­фритическим синдромом и контрольной группой статистически значимых различий не выявлено.

Частота встречаемости ген-генных ассоциаций у детей с острым гломерулонефритом представле­ны в табл. 5.

При остром гломерулонефрите с гормоночув­ствительным нефротическом синдромом - у 9 (29%) обследованных детей выявлены варианты сочетаний гетерозиготных и гомозиготных поли­морфизмов генов: MTHFR 677 C>T + MTRR 66 A>G+ FGB (-455)G>A+ PAI-I (-675) 5G>4G. Но- сительство одного генетического полиморфизма гетерозиготного (либо гомозиготного варианта) гена MTHFR С677Т и гена PAI-I (-675) 5G>4G об­наружено - у 6 (19,4%) , вместе с тем - у 5 (16,1%) пациентов однонуклеотидные полиморфные за­мены обнаружены не были.

При остром ГН нефритическом синдроме со­четание протромботических полиморфных вари­антов генов MTHFR: 677 C>T + MTRR 66 A>G+ FGB (-455)G>A+ PAI-1 (-675) 5G>4G определя­лись у 6 (19,3%) пациентов, носительство одно­го полиморфного варианта гена MTHFR С677Т либо гена PAI-I (-675) 5G>4G зафиксировано - у 4 (12,9%) детей, у 1 (3,2%) ребенка полиморфизма исследованных генов обнаружено не было. У де­тей с нефротическим синдромом сочетание генов системы гемостаза и фолатного цикла выявлены в 55,6% случаев, при остром ГН нефритическом синдроме ген-генные ассоциации обнаружены у 33,3% больных. Определено, что в группе об­следованных детей с НС и детей с острым ГН не­фритическим синдромом чаще встречается одно­нуклеотидная замена в гене PAI-I 5G (-675) 4G, в 50% и 75% соответственно.

Показатели системы гемостаза с учетом рас­пределения протромботических полиморфизмов у 31 ребенка с острым гломерулонефритом пред­ставлены в табл. 6.

Результаты исследования показали, что при носительстве ген-генных ассоциаций протромбо- тических полиморфизмов и при наличии однону­клеотидных минорных замен показатели гемокоа­гуляции, уровень гомоцистеина, статистически значимо отличались от показателей контрольной группы. При носительстве ген-генных ассоциа­ций у детей с острым гломерулонефритом активи­рованное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ) достигает высокой скорости свертывания (р<0,05), чем в группе детей при носительстве го­мозиготных полиморфизмов мажорных аллелей.

Интересно, что высокий уровень гомоцистеина в крови больных детей, достигал уровня стати­стической значимости (р<0,05) при носительстве сочетаний протромботических полиморфизмов генов системы фолатного метаболизма.

ОБСУЖДЕНИЕ

По данным литературы [12-14], полиморфизм в гене MTHFR С677Т приводит к увеличению кон­центрации ГЦ, что существенно влияет на про­грессирование гломерулонефрита, которые прояв­ляются быстрее у пациентов с генотипом ТТ или СТ, а так же при наличии ген-генных ассоциаций генов системы гемостаза и фолатного цикла.

Козловская Н.Л., Боброва Л.А. (2009) указыва­ют, что мультигенетическая тромбофилия являет­ся фактором риска развития тромбозов в микроциркуляторном русле.

По данным К.А Папаян. и соавт. (2015) [14] при сравнении групп детей с НС, первичным и вторичным гломерулонефритом в результате проведенного исследования зарегистрировано малое количество гомозигот по аллелю 677Т гена MTHFR в общей группе больных - 6(4,0%) по сравнению с 10,1% в группе сравнения (OR=0,4; р=0,03). Больных с НС с этим генотипом не вы­явлено. Установили различия в коагуляционном статусе и распределении генотипов ряда генов, ассоциированных с дисфункцией гемостаза у па­циентов с НС, первичном и вторичном ГН. Боль­шая выраженность гиперкоагуляции характеризо­вала пациентов первой группы с гормоночувстви­тельным НС, что сочеталось с высокой частотой мутаций FV Leiden среди пациентов с НС 12,9% (OR=3,2; р=0,05).

По нашим данным, частота мажорного аллеля 5G (-675) гена PAI-1 50% статистически значимо (р=0,042) выше определялась у детей с гормоно­чувствительным НС, чем в контрольной группе. Гетерозиготный генотип 677 СТ гена MTHFR 60% и гетерозиготный генотип 66 АG гена MTRR 70% встречаются с большей частотой, чем в группе контроля.

При сравнении распределения частоты алле­лей, генотипов генов системы гемостаза и фо- латного метаболизма у больных с острым ГН не­фритическим синдромом и контрольной группы, статистически значимых различий не выявлено.

В результате проведенного исследования по­лучены данные о том что у детей с острым гло- мерулонефритом чаще встречаются сочетания протромботических полиморфизмов - у 48,4% (р<0,05), среди которых преобладают компаунды генотипа 677 СТ гена MTHFR и генотипа (-675) 4G5G гена РА1-1 - у 40% детей. При анализе ча­стоты встречаемости тромбогенных аллельных полиморфизмов нами не было обнаружено гете­розиготных и гомозиготных (минорных аллелей) полиморфных вариантов гена FIIG20210A и гена FV G1691A свертывающей системы крови.

В коагуляционном статусе при носительстве ген-генных ассоциаций у детей с острым гломерулонефритом активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ) достигает вы­сокой скорости свертывания, чем в группе детей при носительстве гомозиготных полиморфизмов мажорных аллелей. Высокий уровень гомоцистеина в крови больных детей, определяется при носительстве сочетаний протромботических по­лиморфных вариантов генов системы фолатного метаболизма. Для профилактики тромботических осложнений данной группе больных показана антикоагулянтная терапия [5-9].

Учитывая выявленную взаимосвязь протромботических полиморфизмов с течением и изме­нениями в коагуляционном статусе при остром гломерулонефрите, считаем необходимым даль­нейшее исследование данной проблемы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования пред­ставлен характер и частота встречаемости протромботических полиморфизмов, а также влия­ние на степень выраженности нарушений в систе­ме гемостаза, у детей с гормоночувствительным НС и острым ГН нефритическим синдромом. Установлено, что гетерозиготный генотип 677 СТ гена MTHFR 60% и гетерозиготный генотип 66 AG гена MTRR 70% встречаются с большей часто­той, чем в группе контроля. Характерен высокий уровень гомоцистеина в крови больных детей при носительстве сочетаний протромботических по­лиморфных вариантов генов системы фолатного метаболизма. Более выраженная гиперкоагуляция отмечалась в группе детей с острым гломерулонефритом в сочетании с протромботическими по­лиморфизмами.