МАРКЕРЫ КОЛЛАГЕНООБРАЗОВАНИЯ И СКЛЕРОЗИРОВАНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ ПРОГРЕССИРОВАНИЯ РЕФЛЮКС-НЕФРОПАТИИ У ДЕТЕЙ

ВВЕДЕНИЕ

Инфекция мочевой системы у детей особен­но в сочетании с пузырно-мочеточниковым реф­люксом (ПМР) приводит к развитию рефлюкснефропатии (РН) [1-3]. При прогрессировании РН появляются протеинурия, артериальная ги­пертензия, постепенное снижение функции по­чек, вплоть до развития терминальной почечной недостаточности (тПН). Среди всех детей с тПН в 8-25% случаев причиной явилась прогрессирую­щая РН [4-7]. Поэтому главная цель современной нефрологии - максимальное продление собствен­ных функций почек, что особенно актуально при РН. Следовательно, главный акцент должен быть перенесен на раннюю диагностику и предупре­ждение развития почечных рубцов [8, 9].

Поиск так называемых биомаркеров острого и хронического почечного повреждения, позволяю­щих проводить раннее выявление патологических изменений в почках и определять их характер, дифференцировать поражение разных отделов нефрона, точно установить стадию процесса, оце­нить выраженность воспаления и интенсивность фиброгенеза является наиболее важным [10-12]. Среди таких маркеров, которые все более актив­но исследуются, наибольшее значение имеют трансформирующий фактор роста (TGF-β1), ин­терлейкин-6,8,10, KIM-1 (kidney injury molecule -1), VEGF-А (vascular endothelial growth factor - A), L-FABP (liver type fatty-acid binding protein), NGAL (neutrophil gelatinase-associated lipocalin) и др. [10]. В то же время, в литературе недостаточно освещен вопрос о роли ангиотензина II (AngII) и маркеров коллагенообразования (пептидосвязан­ного и свободного гидроксипролина) в патогенезе РН и не определена их роль в прогрессировании почечного повреждения, что и послужило целью нашего исследования [8, 14, 15]. Являясь основ­ным профиброгенным фактором, инициирующим и поддерживающим процессы фибриллогенеза, AngII повышает синтез TGF-β₁, который стиму­лирует пролиферацию клеток и образование со­единительной ткани [16, 17]. При заболеваниях, связанных с поражением соединительной ткани, увеличивается экскреция гидроксипролина вслед­ствие ускоренного распада и синтеза коллагена. В результате распада, биосинтеза коллагена в кро­ви и моче появляется свободный гидроксипролин (СВО). Большая часть этой аминокислоты катаболизируется под действием фермента гидроксипролиноксидазы, а часть её выводится с мочой, и поэтому гидроксипролин является маркерной аминокислотой, по которой судят о скорости рас­пада и биосинтеза коллагена. Дефекты синтеза коллагена приводят к уменьшению поперечных связей в фибриллах и возрастанию числа легко­растворимых фракций оксипролина, таких как пептид-связанной [18].

Цель исследования: выявить информативные показатели для прогнозирования прогрессиро­вания рефлюкс-нефропатии у детей с пузырно­мочеточниковым рефлюксом на основании иссле­дования мочевой экскреции маркеров склерозиро­вания трансформирующего фактора роста-β₁, ан­гиотензина II, β₂-микроглобулина, прокальцитонина и маркеров коллагенообразования (пептидсвязанного и свободного оксипролина).

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 71 пациент с различной степенью ПМР в возрасте от 1 года до 14 лет (средний возраст 5,69±0,44 года), из них 52 девочки (73,2%), которые находились на обследо­вании в отделениях нефрологии и урологии Ин­ститута Матери и Ребенка (г. Кишинев).

Всем больным было проведено комплекс­ное обследование, которое включало ультразву­ковое исследования органов мочевой системы, УЗИ-допплер почек, микционную цистографию, экскреторную урографию и динамическую не- фросцинтиграфию, клинические анализы крови и мочи, определялись уровень мочевины и креати- нина в крови, скорость клубочковой фильтрации по формуле Шварца, изучалась концентрацион­ная функция почек в пробе Зимницкого и прово­дилось бактериологическое исследование мочи.

Степень ПМР оценивали по результатам мик- ционной цистографии согласно принятой в 1985 г. Международной классификации ПМР [19].

Для выявления РН и определения ее степени всем детям с ПМР была проведена статическая нефросцинтиграфия с ДМСА (димеркаптосукци- новая кислота) в отделении ядерной медицины (зав. отделения - В.В. Карецкая) Республикан­ской клинической больницы (г. Кишинев), но не ранее чем через 3 мес после последнего эпизода инфекции мочевой системы. Степень рефлюкснефропатии определялась согласно классифика­ции А. Piepsz и соавт. (2001): 1 ст. - 1-2 рубца, 2 ст. - 2-3 рубца с сохранной почечной паренхи­мой, 3 ст. - очагово-диффузное распространение склеротических очагов с сохраненным почечным контуром, 4 ст. - «маленькая» или атрофирован­ная почка [20].

В зависимости от наличия и степени выра­женности РН дети были разделены на 3 группы: основная группа (1-я группа) - 62 (87,3%) паци­ента с различной степенью РН: 1А подгруппа - 41 (66,1%) пациент с 1-2 степенью РН (легкая, средний возраст 6,17±0,55 года, 7м/34д) и 1Б подгруппа - 21 (33,9%) пациент с 3-4 степенью РН (тяжелая, средний возраст 6,43±0,86 года, 11м/10д), группа сравнения (2-я группа) - дети с ПМР без РН - 9 (12,7%) детей (средний воз­раст 1,78±0,36 года, 1м/8д) у которых, по данным ДМСА-сцинтиграфии, отсутствовали очаги скле­роза. Контрольную группу (3-я группа) составили 20 практически здоровых детей (8м/12д, средний возраст 6,24±0,31 года) без почечной патологии в анамнезе и на момент включения в исследование.

В утренней моче определяли уровни ангиотен­зина II (AngII), трансформирующего фактора ро­ста (TGF-P₁) и β₂-микроглобулина (β₂-МГ) на био­химическом анализаторе «Униплан» (США) ме­тодом иммуноферментного анализа ELISА с ис­пользованием наборов фирмы «Human TGF-beta-1 Quantikine ELISA Kit» и «Human Angiotensin II Quantikine ELISA Kit» (Великобритания), «Tina- quant a beta 2-microglobulin» (фирма «Boehring Mannhaim»), уровень прокальцитонина (ПКТ) - иммунохроматографическим методом Brachms PCT-Q. Уровень пептид-связанного оксипролина (ПСО) и свободного оксипролина (СВО) в моче определяли по методу П.Н. Шараева (1996). Ме­тод основан на оценке плотности красного хро­могена, получаемого в результате окисления и декарбоксилирования молекулы оксипролина и конденсации продукта окисления с парадимети- ламинобензальдегидом в биохимической лабо­ратории (зав. лабораторией - проф. В. Гудумак) Государственного медицинского университета «Н. Тестимицану» (г. Кишинев). Уровни изучае­мых маркеров в моче пересчитывали на содержа­ние креатинина в данной порции мочи (нг/ммоль креатинина). Все дети на момент исследования находились в клинико-лабораторной ремиссии инфекции мочевой системы (пиелонефрита).

Для оценки результатов исследования ис­пользовали пакет прикладных статистических программ «Statistica 6.0» («StatSoft», США). Дан­ные представлены как частоты и проценты для категориальных и среднего арифметического ± стандартное отклонение для непрерывных пока­зателей. Статистическую значимость различий средних по одному признаку оценивали по кри­терию Манна-Уитни, при сравнительном анали­зе трех групп и более использовался ранговый анализ вариаций по Краскелу-Уоллису; частот - Х²-критерия Пирсона. Оценку силы взаимосвязи между количественными признаками проводили с помощью коэффициента корреляции (Rs) Спир­мена. Нулевую статистическую гипотезу об от­сутствии различий и связей отвергали при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

По данным обследования ПМР I степени вы­являлся у 17 детей (23,9%), ПМР II степени - у 15 детей (21,1%), ПМР III степени - у 14 (19,7%), ПМР IV степени - у 25 детей (35,3%). Односто­ронний ПМР был установлен у 39 детей (54,9%), двусторонний - у 32 (45,1%) (χ²=1,97, p>0,05). Из­учаемые группы больных достоверно не отлича­лись по возрасту и полу. Из анализа цистографий выяснилось, что у 25 больных (35,2%) преоблада­ет левосторонний ПМР, у 14 пациентов (19,7%) - правосторонний, в 45,1% случаев был диагности­рован двусторонний ПМР.

По данным ДМСА-сцинтиграфии, РН была выявлена у 62 (87,3%) пациентов, детей без оча­гов склерозирования было 9 (12,7%).

Тяжелая степень РН определялась в 28,6% случаев при I-II степени ПМР и в 71,4% случаев при III-IV степени ПМР (χ²=3,34, p>0,05). Среди обследованных детей тяжелая степень РН опреде­лялась в основном у мальчиков (52,4%, χ²=10,2, p<0,05).

Установлено, что все дети с ПМР и РН имеют высокий уровень изучаемых маркеров по сравне­нию с группой контроля (табл. 1). Более высокие показатели изучаемых цитокинов были у детей 1Б группы по сравнению с 1А группой и группой сравнения. Выявлена повышенная мочевая кон­центрация TGF-β и AngII в среднем в 2,1 - 3 раза у детей основной группы по сравнению с контроль­ной группой и достоверно выше, чем в группе больных без признаков РН (p<0,001, p<0,05, см. табл. 1).

Установлено, что у всех детей с ПМР независи­мо от наличия и степени почечного повреждения мочевой уровень β₂-МГ был достоверно выше по сравнению с контрольной группой (p<0,05). У па­циентов 1А группы мочевой уровень β₂-МГ был ниже, чем у лиц 1Б группы (р>0,05). Уровень β₂- МГ был достоверно выше у детей основной груп­пы, чем у пациентов группы сравнения (p<0,05).

Уровень СВО в моче был выше в 1,3 раза у де­тей 1Б группы по сравнению с 1А группой и груп­пой сравнения (p<0,05). Повышенный уровень СВО выявлялся у 41 пациента основной группы (67,8%), в том числе у 29 пациентов 1А группы (70,73%) и у 12 пациентов 1Б группы (57,14%, p<0,05). Средний уровень СВО более 82,9 нг/ ммоль Cr (M ± 2δ) встречался у 3 (33,3%) детей без признаков РН (χ²=11,241, p=0,004). Можно предположить, что у этих пациентов уже имеются мелкие очаги склероза в паренхиме почек, кото­рые подвергаются усиленному лизису, что и выра­жается в повышении уровня СВО в моче, но пока еще не выявляются на ДМСА-сцинтиграфии.

Уровень экскреции ПСО с мочой в основной группе был выше, чем в группе контроля, осо­бенно у детей с легкой степенью РН - в 2,8 раза (p<0,05). Не выявлено достоверных различий уровня экскреции ПСО с мочой у детей основной группы и группой сравнения (p>0,05).

Выявлена связь между степенью РН и уровнем ПКТ в моче. Так, в основной группе уровень ПКТ был достоверно выше, чем в группе сравнения (p<0,001). Можно предположить, что это связано с наличием и тяжестью повреждения паренхимы почек. Об этом свидетельствует тот факт, что у де­тей без признаков РН определен достоверно более низкий уровень ПКТ в моче по сравнению с деть­ми 1А и 1Б группой (p<0,001). У детей 1Б группы уровень ПКТ в моче был выше, чем у детей 1А группы (p>0,05).

Таким образом, у больных основной группы все изучаемые показатели по сравнению с груп­пой сравнения были повышенными. В 1Б группе по сравнению с 1А группой чаще выявлялись вы­сокие мочевые концентрации β₂-ΜΓ (q=0,81 vs 0,61), TGF-β₁ (q=0,86 vs 0,71), ПСО (q=0,76 vs 0,51), AngII (q=0,85 vs 0,76), ПКТ (q=0,9 vs 0,63), за исключением СВО, повышенная концентрация которого чаще встречалась у пациентов 1А груп­пы (q=0,7 vs 0,57). В группе сравнения, у детей без признаков склерозирования реже отмечались по­вышенные концентрации изучаемых показателей, в основном это TGF-β₁ (q=0,33), СВО (q=0,56) и AngII (q=0,45).

Установлено минимальное пороговое значение изучаемых показателей для диагностики ранних склеротических изменений у детей с ПМР. Чув­ствительность и специфичность изучаемых по­казателей в качестве диагностических маркеров склерозирования представлена в табл. 2.

Было показано, что наибольшая чувствитель­ность и специфичность (97,6 и 96,9% в основной группе) выявлена для ПКТ (уровень 2,4 нг/ммоль Cr); меньше (чувствительность и специфичность 77,6 и 92,3% в основной группе) выявлена для AngII (уровень 58,3 нг/ммоль Cr). Остальные из­учаемые показатели имели меньшую специфич­ность и чувствительность.

При корреляционном анализе установлена наи­более значимая положительная достоверная связь таких маркеров как AngII и TGF-β₁ с выраженностью РН у детей, что свидетельствует о прогно­стической значимости этих маркеров (табл. 3).

У детей основной группы степень коллагенообразования и микроглобулинурии была более выраженной, чем у детей группы сравнения, что подтверждается установленной умеренной силы положительной корреляционной связью между мочевым уровнем β₂-МГ и показателями коллагенообразования ПСО (рис. 1), а также более выра­женная степень склероза в виде сильной прямой корреляции между уровнем AngII и профиброгенным маркером TGF-β₁, и указывает на гиперпро­дукцию данных цитокинов и усиленную проли­ферацию фибробластов с разрастанием соедини­тельной ткани (рис. 2). У детей группы сравнения (дети без признаков РН) процессы склерозирова­ния более интенсивны, чем у детей со склеротиче­скими процессами, что подтверждается выявлен­ной умеренной силы отрицательной корреляцион­ной связи между СВО и AngII (рис. 3) и сильной непрямой корреляционной связью между AngII и ПСО (рис. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение ранних диагностических маркеров формирования и прогрессирования тубулоинтерстициального фиброза, среди которых важное место отводят профиброгенным маркерам, счи­тают перспективным направлением в детской не­фрологии. Интерес поиска диагностических мар­керов возрос с появлением доступных методов определения уровня цитокинов не только в крови, но и в моче, позволяющих оценить активность и характер течения процесса в почечной ткани. По­скольку проксимальные канальцы, поврежденные ишемией, являются основным источником фак­торов роста, значительное повышение содержа­ния TGF-β₁ и AngII в моче по мере возрастания тяжести тубулоинтерстициального повреждения указывает на гиперпродукцию данных цитокинов и усиленную пролиферацию фибробластов с раз­растанием соединительной ткани, что подтверж­дается данными литературы [21-23]. В нашем ис­следовании повышение уровня AngII и TGF-β₁ у части детей с ПМР без признаков РН возможно обусловлена инфильтрацией почечного интерстиция макрофагами и лимфоцитами в очаге воспале­ния, что можно расценить как пресклеротическую стадию развития РН. Выявлена прямая сильная корреляционная связь между мочевыми показа­телями TGF-β₁ и AngII у больных с РН, и именно у этих больных были обнаружены высокие пока­затели изучаемых маркеров, что может служить дополнительным диагностическим критерием тубулоинтерстициального повреждения и уменьше­ния нормально функционирующей почечной тка­ни, что было отмечено и другими авторами. Так, схожие результаты были получены А. Sabasinsca и соавт. (2008), обнаружившие высокую прямую корреляционную связь между мочевой экскреци­ей TGF-β₁ у детей с ПМР, тяжестью самого рефлюкса и почечным повреждением [24]. Рядом ав­торов было отмечено наличие тесной связи между уровнем TGF-β₁ в моче и степенью тяжести по­вреждения почечной ткани у детей с ПМР, ослож­ненным РН [25].

О значении β₂-ΜΓ, как одного из ранних марке­ров повреждения тубулоинтерстициальной ткани, свидетельствуют выявленные средней силы кор­реляционные связи между мочевым уровнем β₂- МГ и показателями коллагенообразования ПСО (r=0,578, р<0,001). Повышенный мочевой уровень β₂-ΜΓ у пациентов с тяжелой степенью РН отража­ет, прежде всего, тяжесть повреждения эпителия проксимальных канальцев, прежде всего, за счет деструкции и нарушения процессов реабсорбции в них. При наличии латентно-текущего интерсти­циального воспаления повреждения тубулоинтерстиция почечными белками приводит к усилению гипоксии канальцевых клеток с формированием тубулярной атрофии и разрушением в них лизосом [26]. Указанные механизмы поражения ка­нальцевых клеток, по-видимому, имеют место как в начале развития тубулоинтерстициального про­цесса, так и в последующем, усугубляясь по мере формирования склероза [10, 26-29]. У пациентов с ПМР, осложненным РН, повышенная мочевая экскреция β₂-ΜΓ выявлялась чаще, чем в группе детей с ПМР без РН, что позволяет его предло­жить в качестве маркера для раннего выявления среди детей с ПМР больных с РН. Полученные данные согласуются с результатами, полученны­ми А. Kaminska и соавт. (2000), которые показа­ли, что повышенный уровень микроглобулинов в моче отражает степень интерстициального по­вреждения у детей с ПМР [30].

Результаты исследования установили, что у всех больных с тяжелой степенью РН выявлял­ся выраженный дисбаланс между разрушением сформированного коллагена и его синтезом, что проявлялось высокой мочевой экскрецией СВО и относительно более низкой экскрецией ПСО с мочой. В отличие от этого при легкой степени РН преобладала экскреция ПСО с мочой, а выделе­ние СВО не отличалось от его выделения у детей с ПМР, но без развития РН. Мы предполагаем, что выделяемый с мочой СВО, который является про­дуктом распада коллагена, может служить пока­зателем интенсивности данного процесса при РН. Это соответствует результатам, представленным в работе K.I. Kivirikko (1970), где было показа­но, что грануляционно-фиброзная ткань, наряду с усилением биосинтеза коллагена, характеризует­ся и усиленным его распадом, особенно в стадии окончательной организации рубца [31]. Учиты­вая, что СВО в моче является чувствительным ин­дикатором как распада коллагена, так и коллагенообразования, он может использоваться в клини­ческой практике для выявления склеротических процессов в почечной ткани у детей с ПМР [32].

Выявлены высокая специфичность и чувстви­тельность мочевой экскреции провоспалительного цитокина ПКТ для мониторирования степени склероза при ПМР. Было показано, что уровень ПКТ в моче зависит от степени почечного повреж­дения и канальцевой дисфункции. Возможно, при рецидивирующей ИМС у детей с ПМР и РН раз­вивается хронический воспалительный процесс в почках, который приводит к повышенному синтезу эндотоксинов и провоспалительных цитокинов в результате их воздействия на щитовидную железу, что, в свою очередь, приводит к усилению синтеза ПКТ и повышению его уровня в крови. При этом в моче наблюдается повышение уровня ПКТ как за счет фильтрации через гломерулярный фильтр его большего количества, так и за счет нарушения его реабсорбции, обусловленного повреждением проксимальных канальцев нефрона [33]. Наиболее высокий уровень ПКТ в моче наблюдался у детей с III-IV степенями РН и был почти в 6 раз выше, чем у детей без РН. Несмотря на то, что роль ПКТ в воспалительной реакции и цитокиновом каска­де при почечном повреждении остается неизвест­ной, его использование в диагностике инфекции мочевой системы оценивается различными авто­рами чрезвычайно высоко [34-39]. S. Leroy и со­авт. (2011) определили стабильную зависимость между концентрацией ПКТ в крови и степенью ПМР и предложили использование ПКТ при об­следовании больных с ИМС [34]. В то же время, на положительную корреляцию между уровнем ПКТ в крови, острофазовыми показателями и ПМР у 52 детей с острым пиелонефритом отметили S. Bressan и соавт. (2009), но не нашли зависимость его от степени ПМР [39]. Нам представляется, что вы­явленная связь со степенью РН косвенная, и уро­вень ПКТ в моче зависит, прежде всего, от тяжести РН и выраженности воспалительного, в том числе и латентно протекающего, процесса в почечной ткани. Наши исследования косвенно согласуют­ся с исследованиями А. Kotoula и соавт. (2009). Авторы определили высокую корреляцию между ПКТ в крови у больных с почечными рубцами при сравнении с больными без рубцов и предложили использовать его как ранний маркер рубцевания почечной ткани [40].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя полученные данные, можно пред­положить, что основной причиной, приводящей к прогрессированию РН у больных детей с ПМР, является повышенная продукция факторов роста в условиях формирующейся РН. Установленная прямая корреляционная связь между уровнем экс­креции изучаемых профиброгенных факторов и степенью тяжести РН у больных с ПМР свидетель­ствует о целесообразности и перспективности их включения в качестве диагностических маркеров прогнозирования тяжести рефлюкс-нефропатии.

Установлена выраженная корреляционная связь мочевого уровня трансформирующего фак­тора роста-β₁ и ангиотензина II с почечным по­вреждением, что отражает прогрессирующий воспалительный и склерозирующий тубулоинтерстициальный процесс.

Уровень прокальцитонина в моче был в 3,5 раза выше у детей с РН, чем у детей без повреждения почечной ткани, что позволяет предложить опре­деление этого показателя в качестве неинвазивно­го диагностического маркера в определении по­чечного повреждения при наблюдении за детьми с ПМР и инфекцией мочевой системы до проведе­ния ДМСА-сцинтиграфии.

Мочевой уровень β₂-микроглобулина у детей основной группы был почти в 2 раза выше, чем в группе детей без очагов склероза в почечной тка­ни, и отражает более тяжелое повреждение эпите­лия проксимальных канальцев.

Установлена зависимость между образовани­ем и разрушением коллагена и степенью тубулоинтерстициального фиброза в виде повышения фракций свободного оксипролина.

Определение в моче уровня ангиотензина II, трансформирующего фактора роста-β₁ прокальцитонина с последующим пересчетом показате­лей на креатинин мочи целесообразно использо­вать в качестве дополнительных диагностических критериев формирования и прогрессирования хронического воспалительного процесса в почеч­ной ткани у детей с ПМР. Установленная прямая корреляционная связь между уровнем экскреции AngII, TGF-β_1, ПКТ и степенью тяжести РН у больных с ПМР свидетельствует о целесообраз­ности и перспективности их включения в каче­стве диагностических маркеров прогнозирования тяжести рефлюкс-нефропатии.