Preview

Нефрология

Расширенный поиск

Есть ли дневные вариации микробиоты мочи у здоровых женщин?

Полный текст:

Аннотация

ЦЕЛЬ: исследование микробиоты мочи у здоровых женщин в дневное время суток. ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ. Проведено бактериологическое исследование мочи у 20 здоровых сексуально активных женщин в различное время суток (8:00, 12:00, 16:00). Исследование мочи проводили на расширенном наборе питательных сред для факультативно-анаэробных и неклостридиально-анаэробных бактерий. Использованы 10 питательных сред. Для создания анаэробных условий использовали HiAnaerobic System - Mark VI или AnaeroHiGas Pak. Расчеты выполняли в среде статистической обработки и визуализации данных R. РЕЗУЛЬТАТЫ. При бактериологическом исследовании 60 образцов мочи стерильные посевы отсутствовали. В группе факультативно-анаэробных бактерий в течение дня с высокой частотой (>60,0%) обнаруживали коагулазоотрицательные стафилококки и Corynebacterium spp. В группе неклостридиально- анаэробных бактерий стабильными ассоциантами являлись Eubacterium spp., Peptococcus spp., Propionibacterium spp., Lactobacillus spp. Уровень бактериурии для всех верифицированных в моче у здоровых женщин микроорганизмов в подавляющем большинстве случаев был <103 КОЕ/мл. Значимые различия по частоте обнаружения различных родов бактерий в моче в течение дня отсутствовали. Значимых различий в уровнях бактериурии не выявлено за исключением 3 родов. Дендрограммы свидетельствуют о высоком уровне подобия частоты присутствия и концентрации микроорганизмов в различные сроки. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. У здоровых женщин характерный спектр мочи идентифицируется независимо от времени дня.

Для цитирования:


Набока Ю.Л., Коган М.И., Гудима И.А., Заруцкий С.А., Джалагония К.Т. Есть ли дневные вариации микробиоты мочи у здоровых женщин? Нефрология. 2016;20(5):36-42.

For citation:


Naboka Y.L., Kogan M.I., Gudima I.A., Zarutskiy S.A., Jalagonia K.T. Does the urine microbiota of healthy women vary during daytime? Nephrology (Saint-Petersburg). 2016;20(5):36-42. (In Russ.)

ВВЕДЕНИЕ

В течение многих десятилетий существовала аксиома о стерильности мочи у здорового чело­века [1, 2]. Работы последних лет по индикации микроорганизмов в моче развенчали этот миф [3­7]. При бактериологическом исследовании мочи у здоровых женщин был верифицирован широ­кий паттерн факультативно-анаэробных (ФАБ) и неклостридиально-анаэробных бактерий (НАБ). Более того, метод индикации 16S РНК позволил выявить в моче у здоровых людей 45 родов раз­личных микроорганизмов, причем большинство из них были отнесены к анаэробным и труднокультивируемым бактериям [5].

Однако метод пиросеквенирования в силу вы­сокой сложности и дороговизны еще длительное время будет недоступен в повседневной лабора­торной практике. Поэтому бактериологическое исследование мочи, считающиеся «золотым стан­дартом» диагностики, будет оставаться таковым при инфекции верхних и нижних мочевых путей. Согласно классическим канонам, бактериологи­ческому исследованию подлежит средняя пор­ция утренней мочи или моча, взятая катетером, или путем надлобковой мочепузырной пункции, интерпретация результатов которой проводится в соответствии с рекомендациями Европейской ассоциации урологов [8]. При этом сбор мочи осуществляется после соответствующей гигие­нической процедуры с целью минимизировать контаминацию образца мочи [9]. Этим правилам практически неукоснительно следуют при плано­вом обследовании пациентов с инфекцией моче­вых путей (ИМП). Однако существует определен­но большая группа больных, которые поступают в стационар экстренно в связи с тяжело проте­кающей острой осложненной или неосложненной ИМП, когда необходимо срочно произвести забор мочи для бактериологического исследования до назначения антибактериальной терапии. Возни­кает абсолютно логичный вопрос: отличается ли кардинально спектр выделенных из мочи микро­организмов и их количество в утренние, дневные и вечерние часы? Для ответа на этот вопрос мы провели бактериологическое исследование мочи у здоровых женщин в дневное время суток.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Проведено бактериологическое исследование средней порции мочи у 20 молодых (17-21 год, средний возраст - 19,5±1,5 лет) здоровых сексу­ально активных женщин в дневное время (8:00, 12:00 и 16:00 ч). Критерии включения в исследо­вание: возраст до 22 лет, отсутствие гинекологи­ческих и урологических заболеваний, инфекций, передающихся половым путем в анамнезе и на момент обследования, а также отсутствие ин­фекционных заболеваний в течение года, генети­ческих, системных, аутоиммунных поражений, факторов риска (радиоактивное облучение и т.д.), отсутствие патологических изменений почек, мочевой системы, внутренних половых органов при ультразвуковом исследовании, приема лекар­ственных препаратов, в том числе антибиотиков, кортикостероидов последние 2 мес, формально­нормативные показатели общего анализа крови и мочи, согласие обследуемых на участие в иссле­довании.

Образцы мочи в исследуемых группах, по­сле соответствующей гигиенической процедуры, собирал специально обученный медицинский персонал при самостоятельном мочеиспуска­нии пациентов в 8:00, 12:00 и 16:00. Образцом для бактериологического исследования являлась средняя порция мочи, отобранная в стерильный одноразовый контейнер. Пробы кодировали иден­тификационным номером. Для культивирования ФАБ применяли питательные среды MacConkey Agar, HiCrome Candida Differential Agar, HiCrome Enterococci Agar, HiCrome Aureus Agar Base, Blood Agar, приготовленный на основе Mueller Hinton agar с добавлением бараньих эритроцитов, а для культивирования НАБ - Anaerobic Agar, Shaedler Broth, Shaedler Agar, Bacteroides Bile Esculinum Agar, MRS Agar. Посевы ФАБ инкубировали в термостате 24-48 ч, анаэробных - 48-72 ч (тем­пература 37 0C). Для создания анаэробных усло­вий использовали HiAnaerobic System - Mark VI с индикатором анаэробиоза (HiAnaero Indicator Tablet) в присутствии газовой смеси (10% CO2, 10% H2, 80% N2) или AnaeroHiGas Pak. Идентифи­кацию выделенных бактерий проводили по мор­фологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим признакам с помощью энтеро-, стафило-, неферм-, анаэростестов («Lachema», Чехия).

Статистический анализ выполняли в среде ста­тистической обработки и визуализации данных «R ver 3.2» («R Foundation for Statistical Computing», Вена, Австрия,). Данные представлены при нор­мальном распределении в виде медиана и интерквартильный размах (Ме, 25% квартиль; 75 квартиль). Сравнение медианных концентраций микроорганизмов в порциях мочи, взятых в раз­личные промежутки времени, проводили с помо­щью теста Фридмана (попарные апостериорные сравнения осуществляли с помощью метода Неменьи). Сравнение встречаемости микроорганиз­мов оценивали с помощью теста Кохрана. Для обоих тестов использовали поправку на множе­ственные сравнения по Холму. Различия призна­вали статистически значимыми на уровне р<0,05. Для кластеризации результатов анализов для всех временных точек были построены дендрограммы. Для анализа сходства использовали метод Варда (расстояние Брея-Кёртиса).

РЕЗУЛЬТАТЫ

У молодых здоровых и сексуально активных женщин при трехкратном (в течение дня) бакте­риологическом исследовании мочи обнаружено 7 родов ФАБ, дрожжеподобные грибы рода Candida и 10 родов НАБ. ФАБ обнаруживаются в моче всегда во все исследуемые сроки. В этой группе в течение дня доминируют (>60,0%) коагулазо- отрицательные стафилококки (КОС) и Corynebacterium spp. В то же время, большинство других представителей ФАБ встречаются с низкой часто­той (до 20,0%). Таким образом, выделяются под­группы ФАБ с постоянно высокой и низкой ча­стотой обнаружения. Имеет место непостоянное присутствие в моче некоторых ФАБ: Streptococcus spp., S.aureus и Micrococcus spp. (рис. 1). Средний уровень бактериурии для ФАБ составляет утром 101,7 КОЕ/мл, днем - 101,5 КОЕ/мл, вечером - 101,9 КОЕ/мл.

НАБ аналогично ФАБ постоянно присутству­ют в дневной моче. Среди НАБ не выделяются подгруппы по частоте выделения бактерий. Не­которые таксоны НАБ (Eubacterium spp., Pepto- coccus spp., Propionibacterium spp. и Lactobacillus spp.) являются стабильными по частоте выделе­ния в дневной моче, а большинство - имеют не­значительные колебания частоты обнаружения в течение дня (рис. 2). Таким образом, можно говорить об определенном постоянстве частоты обнаружения НАБ в моче. Средний уровень бак­териурии НАБ во все сроки исследования был <102 КОЕ/мл. Исключение составляют Leptospira spp., Bacteroides spp, Fusobacterium spp, уровень бактериурии которых колеблется в пределах 102­-104 КОЕ/мл.

 

Рис. 1. Частота обнаружения факультативно-анаэробных бактерий в дневной моче.

 

 

Рис. 2. Частота обнаружения неклостридиально-анаэробных бактерий в дневной моче.

 

 

Таблица 1

Сравнение встречаемости микроорганизмов в образцах мочи, взятой у одних и тех же женщин в разные промежутки времени

Показатель

t=8:00, n (%)

t=12:00, n (%)

t=16:00, n (%)

p

p8:00&12:00

p8:00&16:00

p12:00&16:00

Bacteroides spp.

2 (10)

2 (10)

4 (20)

0,51

1

1

1

Bifidobacterium spp.

2 (10)

6 (30)

2 (10)

0,07

0,38

1

0,38

Candida spp.

2 (10)

4 (20)

2 (10)

0,37

1

1

1

Corynebacterium spp.

12 (60)

12 (60)

16 (80)

0,07

1

0,38

0,38

Enterococcus spp.

14 (70)

16 (80)

12 (60)

0,37

1

1

0,38

Eubacterium spp.

20 (100)

20 (100)

20 (100)

NV

NV

NV

NV

Fusobacterium sp.

2 (10)

6 (30)

2 (10)

0,14

0,58

1

0,38

Lactobacillus spp.

14 (70)

14 (70)

12 (60)

NV

NV

NV

NV

Leptospira spp.

2 (10)

2 (10)

2 (10)

NV

NV

NV

NV

Megasphaera spp.

2 (10)

2 (10)

0 (0)

1

NV

NV

NV

Micrococcus spp.

0 (0)

2 (10)

0 (0)

NV

NV

NV

NV

Peptococcus spp.

16 (80)

20 (100)

20 (100)

NV

NV

NV

NV

Peptostreptococcus spp.

4 (20)

6 (30)

4 (20)

0,67

1

1

1

Propionibacterium spp.

16 (80)

14 (70)

16 (80)

0,61

1

1

1

S.aureus

0 (0)

2 (10)

2 (10)

NV

NV

NV

NV

Streptococcus spp.

0 (0)

0 (0)

2 (10)

NV

NV

NV

NV

Veillonella spp.

2 (10)

8 (40)

8 (40)

0,027

0,09

0,22

1

КОС

16 (80)

20 (100)

18 (90)

0,41

NN

0,69

NN

Примечания. В таблице встречаемость представлена в виде частот; сравнение осуществлялось с помощью теста Кохрана с поправкой на множественные сравнения по Холму. NN - недостаточно наблюдений для вычисления p; NV - по данному при­знаку различия отсутствуют.

В соответствии с данными сравнения встре­чаемости микроорганизмов в образцах мочи, взя­той у одних и тех же женщин в разные периоды суток (табл. 1), можно констатировать отсутствие значимых различий в исследуемые сроки для всех микроорганизмов за исключением Veillonella spp. Тем не менее, значимых различий в парных сравнениях для Veillonella spp. не зафиксировано.

Значимые различия (табл. 2) в уровнях бактериурии в течение дня обнаружены только для представителей трех родов (Eubacterium spp., Veillonella spp., КОС). Однако медианные кон­центрации по этим микроорганизмам совпада­ют, за исключением уровня бактериурии для Eubacterium spp. (концентрация в 16:00 в 2 раза выше, чем в 12:00). Тем не менее, ни по одному из этих микроорганизмов значимости в парных сравнениях не зафиксировано.

Несмотря на отсутствие статистически значи­мых отличий по отдельным микроорганизмам, интерес также представляют возможные много­факторные паттерны: суммирование небольших отличий может привести к высокой кластериза­ции (что зависит от величины и направления кор­реляций между микроорганизмами).

Для анализа этого вопросы были построены дендрограммы для кластеризации по спектру (рис. 3) и концентрации (рис. 4) всех рассмотрен­ных микроорганизмов. Однако многофакторные паттерны также не были выявлены. На дендро­граммах присутствуют два кластера, в составе ко­торых практически в равной степени встречаются пробы мочи, взятые во все три промежутка вре­мени у одного и того же человека. Таким образом, уровень подобия результатов трех дневных изме­рений у одной и той же обследуемой достаточно высок. С другой стороны - уровень подобия ми­кробиоты мочи между разными женщинами, не­зависимо от времени взятия у них материала для исследования, относительно низок.

Таким образом, результаты сравнений свиде­тельствуют о том, что существуют незначитель­ные различия в спектре микроорганизмов в моче и уровнях бактериурии у отдельных индивиду­умов в течение дневного времени. Однако в целом у здоровой женщины характерный спектр мочи идентифицируется независимо от дневного вре­мени взятия материала для исследования.

ОБСУЖДЕНИЕ

Существующая стагнация в расшифровке этиологической структуры ИМП заключается в ограниченности стандартного протокола исследо­вания мочи, который предназначен для быстрого обнаружения определенной группы известных уропатогенов, как правило, представителей се­мейства Enterobacteriaceae [10]. Поэтому, призна­вая важность изучения бактериальных сообществ в норме и при различных патологических состоя­ниях, Национальным институтом здоровья США был инициирован «Human microbiome project», который во многом поколебал существующие представления «о стерильности» различных био­топов и расширил знания о микробиоте и микробиоме человека (http://nihroadmap.nih.gov/hmp/, www.human-microbiome.org). На сегодняшний день расширен круг уропатогенов, включающий анаэробные бактерии, для пациентов с симптома­ми поражения нижних мочевых путей [7, 11, 12]. Современные методы идентификации бактерий показали, что 80,0% образцов мочи с отрицатель­ными результатами стандартного исследования содержат широкий паттерн бактерий, в частности Lactobacillus spp., Actinoimyces spp., Corynebacterium spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp. [11]. Получены новые данные о потенциально важных различиях микробиома мочи у женщин с недержанием и без недержания мочи [12]. Все это свидетельствует лишь о том, что многие без­альтернативные постулаты о стерильности мочи, неизменности стандартного бактериологического протокола исследования мочи требуют пересмо­тра. К этой же категории парадигм, на наш взгляд, относится и сбор утренней мочи для проведения бактериологического исследования. Исследова­ние на расширенном наборе питательных сред для аэробных и анаэробных бактерий показало отсутствие значимых отличий для большинства видов. Таким образом, паттерны и концентрации микроорганизмов в моче здоровых женщин в те­чение дня существенно не менялись.

 

Таблица 2

Сравнение медианных концентраций микроорганизмов, взятых у одних и тех же женщин в разные промежутки времени

Показатель

t=8:00

t=12:00

t=16:00

p

p8:00&12:00

p8:00&16:00

p12:00&16:00

Bacteroides spp.

0 (0-0)

0 (0-0)

0 (0-0)

0,51

1

1

1

Bifidobacterium spp.

0 (0-0)

0 (0-1)

0 (0-0)

0,07

1

1

1

Candida spp.

0 (0-0)

0 (0-0)

0 (0-0)

0,37

1

1

1

Corynebacterium spp.

1 (0-3)

1 (0-2)

1 (1-2)

0,23

1

1

1

Enterococcus spp.

1 (0-2)

1 (1-2)

1(0-1)

0,45

1

1

1

Eubacterium spp.

3 (1-3)

1.5 (1-3)

3(2-3)

0,007

0.66

0.66

0.14

Fusobacterium sp.

0 (0-0)

0 (0-1)

0 (0-0)

0,14

1

1

1

Lactobacillus spp.

1.5 (0-4)

1.5 (0-3)

1 (0-2)

0,28

1

1

1

Leptospira spp.

0 (0-0)

0 (0-0)

0 (0-0)

0,14

1

1

1

Megasphaera spp.

0 (0-0)

0 (0-0)

0 (0-0)

0,37

1

1

1

Micrococcus spp.

0 (0-0)

0 (0-0)

0 (0-0)

0,14

1

1

1

Peptococcus spp.

1(1-1)

1 (1-1)

1 (1-1)

0,61

1

1

1

Peptostreptococcus spp.

0 (0-0)

0 (0-1)

0 (0-0)

0,42

1

1

1

Propionibacterium spp.

1 (1-1)

1 (0-1)

1 (1-1)

0,66

1

1

1

S.aureus

0 (0-0)

0 (0-0)

0 (0-0)

0,14

1

1

1

Streptococcus spp.

0 (0-0)

0 (0-0)

0 (0-0)

0,14

1

1

1

Veillonella spp.

0 (0-0)

0 (0-1)

0(0-1)

0,027

0.99

0.99

1

КОС

1 (1-1)

1 (1-1)

1 (1-1)

0,03

0.99

1

1

Примечания. В таблице значения представлены в виде медиана (нижний квартиль - верхний квартиль) и выражены на ло­гарифмической шкале; сравнение осуществлялось с помощью теста Фридмана-Неменьи с поправкой на множественные сравнения по Холму.

 

Рис. 3. Иерархическая кластеризация спектра микроорганизмов в моче в периоды 8.00 (У), 12.00 (Д), 16.00 (В).

 

 

Рис. 4. Иерархическая кластеризация концентрации микроорганизмов в моче в сроки 8.00 (У), 12.00 (Д), 16.00 (В).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У молодых здоровых сексуально активных женщин при трехкратном бактериологическом исследовании в моче верифицируется широкий паттерн ФАБ и НАБ. Среди ФАБ доминируют коагулазоотрицательные стафилококки и Corynebacterium spp. НАБ являются постоянными ассоциантами микробиоты мочи в течение дня. В группе НАБ доминирующими родами являются Lactobacillus spp., Peptococcus spp., Propionibacterium spp., Eubacterium spp. В течение дня значи­мые различия в частоте обнаружения различных таксонов микроорганизмов отсутствуют за ис­ключением Veillonella spp. Значимые различия в уровнях бактериурии в течение дня обнаруже­ны только для Eubacterium spp., Veillonella spp. и КОС.

Таким образом, частота обнаружения и кон­центрация ФАБ и НАБ в моче являются относи­тельно стабильными показателями. Поэтому бак­териологическое исследование мочи при наличии к нему показаний может производиться в течение дневного времени суток с одинаковой степенью достоверности.

Список литературы

1. Воробьев АА. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. МИА, М., 2004; 690

2. Osborne NG. Acute urinary-tract infection: a condition over-diagnosed in women? J of Gynecologic Surgery 2008;24(1):51-54

3. Коган МИ, Набока ЮЛ, Гудима ИА и др. Микробный спектр мочи молодых здоровых женщин. Урология 2010;5:7-10

4. Naboca JL, Kogan MI, Gudima IA et al. Harnflora bei gesunden frauen. ArchivEuroMedica 2011;1-2:155-157

5. Siddiqui H, Nederbragt AJ, Lagesen K et al. Assesing diversity of the female urine microbiota by high throughput sequencing of 16S RNA amplicons. BMC Microbiol 2011;11:244-251

6. Fouts DE, Pieper R, Szpakowski S et al. Integrated next-generation sequencing of 16S rDNA and metaproteomics differentiate the healthy urine microbiome from asymptomatic bacteriuria in neuropathic bladder associated with spinal cord injury. J Transl

7. Wolfe AJ, Toh E, Shibata N et al. Evidence of uncultivated bacteria in the adult female bladder. J Clin Microbiol 2012; 50(4):1376-1383

8. Клинические рекомендации. Европейская ассоциация урологов. 2015 [Klinicheskie rekomendatsii. Evropeyskaya assotsiatsiya urologov. 2015]

9. Методические указания МУ 4.2.2039-05. Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории, М., 2006; 43-59

10. Wolfe AJ, Brubaker L. «Sterile urine» and the presence of bacteria. Eur Urol 2015;68:173-174

11. Hilt EE, McKinley K, Pearce MM et al. Urine is not sterile: use of enhanced urine culture techniques to detect resident bacterial flora in the adult female bladder. J Clin Microbiol 2014;52(3):871-876

12. Pearce MM, Hilt EE, Rosenfeld AB et al. The female urinary microbiome: a comparison of women with and without urgency urinary incontinence. Mbio 2014;5(4):є01283-14


Об авторах

Ю. Л. Набока
Ростовский государственный медицинский университет
Россия


М. И. Коган
Ростовский государственный медицинский университет
Россия


И. А. Гудима
Ростовский государственный медицинский университет
Россия


С. А. Заруцкий
Ростовский государственный медицинский университет
Россия


К. Т. Джалагония
Ростовский государственный медицинский университет
Россия


Для цитирования:


Набока Ю.Л., Коган М.И., Гудима И.А., Заруцкий С.А., Джалагония К.Т. Есть ли дневные вариации микробиоты мочи у здоровых женщин? Нефрология. 2016;20(5):36-42.

For citation:


Naboka Y.L., Kogan M.I., Gudima I.A., Zarutskiy S.A., Jalagonia K.T. Does the urine microbiota of healthy women vary during daytime? Nephrology (Saint-Petersburg). 2016;20(5):36-42. (In Russ.)

Просмотров: 198


ISSN 1561-6274 (Print)
ISSN 2541-9439 (Online)