Есть ли дневные вариации микробиоты мочи у здоровых женщин?

ВВЕДЕНИЕ

В течение многих десятилетий существовала аксиома о стерильности мочи у здорового чело­века [1, 2]. Работы последних лет по индикации микроорганизмов в моче развенчали этот миф [3­7]. При бактериологическом исследовании мочи у здоровых женщин был верифицирован широ­кий паттерн факультативно-анаэробных (ФАБ) и неклостридиально-анаэробных бактерий (НАБ). Более того, метод индикации 16S РНК позволил выявить в моче у здоровых людей 45 родов раз­личных микроорганизмов, причем большинство из них были отнесены к анаэробным и труднокультивируемым бактериям [5].

Однако метод пиросеквенирования в силу вы­сокой сложности и дороговизны еще длительное время будет недоступен в повседневной лабора­торной практике. Поэтому бактериологическое исследование мочи, считающиеся «золотым стан­дартом» диагностики, будет оставаться таковым при инфекции верхних и нижних мочевых путей. Согласно классическим канонам, бактериологи­ческому исследованию подлежит средняя пор­ция утренней мочи или моча, взятая катетером, или путем надлобковой мочепузырной пункции, интерпретация результатов которой проводится в соответствии с рекомендациями Европейской ассоциации урологов [8]. При этом сбор мочи осуществляется после соответствующей гигие­нической процедуры с целью минимизировать контаминацию образца мочи [9]. Этим правилам практически неукоснительно следуют при плано­вом обследовании пациентов с инфекцией моче­вых путей (ИМП). Однако существует определен­но большая группа больных, которые поступают в стационар экстренно в связи с тяжело проте­кающей острой осложненной или неосложненной ИМП, когда необходимо срочно произвести забор мочи для бактериологического исследования до назначения антибактериальной терапии. Возни­кает абсолютно логичный вопрос: отличается ли кардинально спектр выделенных из мочи микро­организмов и их количество в утренние, дневные и вечерние часы? Для ответа на этот вопрос мы провели бактериологическое исследование мочи у здоровых женщин в дневное время суток.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Проведено бактериологическое исследование средней порции мочи у 20 молодых (17-21 год, средний возраст - 19,5±1,5 лет) здоровых сексу­ально активных женщин в дневное время (8:00, 12:00 и 16:00 ч). Критерии включения в исследо­вание: возраст до 22 лет, отсутствие гинекологи­ческих и урологических заболеваний, инфекций, передающихся половым путем в анамнезе и на момент обследования, а также отсутствие ин­фекционных заболеваний в течение года, генети­ческих, системных, аутоиммунных поражений, факторов риска (радиоактивное облучение и т.д.), отсутствие патологических изменений почек, мочевой системы, внутренних половых органов при ультразвуковом исследовании, приема лекар­ственных препаратов, в том числе антибиотиков, кортикостероидов последние 2 мес, формально­нормативные показатели общего анализа крови и мочи, согласие обследуемых на участие в иссле­довании.

Образцы мочи в исследуемых группах, по­сле соответствующей гигиенической процедуры, собирал специально обученный медицинский персонал при самостоятельном мочеиспуска­нии пациентов в 8:00, 12:00 и 16:00. Образцом для бактериологического исследования являлась средняя порция мочи, отобранная в стерильный одноразовый контейнер. Пробы кодировали иден­тификационным номером. Для культивирования ФАБ применяли питательные среды MacConkey Agar, HiCrome Candida Differential Agar, HiCrome Enterococci Agar, HiCrome Aureus Agar Base, Blood Agar, приготовленный на основе Mueller Hinton agar с добавлением бараньих эритроцитов, а для культивирования НАБ - Anaerobic Agar, Shaedler Broth, Shaedler Agar, Bacteroides Bile Esculinum Agar, MRS Agar. Посевы ФАБ инкубировали в термостате 24-48 ч, анаэробных - 48-72 ч (тем­пература 37 ⁰C). Для создания анаэробных усло­вий использовали HiAnaerobic System - Mark VI с индикатором анаэробиоза (HiAnaero Indicator Tablet) в присутствии газовой смеси (10% CO₂, 10% H₂, 80% N₂) или AnaeroHiGas Pak. Идентифи­кацию выделенных бактерий проводили по мор­фологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим признакам с помощью энтеро-, стафило-, неферм-, анаэростестов («Lachema», Чехия).

Статистический анализ выполняли в среде ста­тистической обработки и визуализации данных «R ver 3.2» («R Foundation for Statistical Computing», Вена, Австрия,). Данные представлены при нор­мальном распределении в виде медиана и интерквартильный размах (Ме, 25% квартиль; 75 квартиль). Сравнение медианных концентраций микроорганизмов в порциях мочи, взятых в раз­личные промежутки времени, проводили с помо­щью теста Фридмана (попарные апостериорные сравнения осуществляли с помощью метода Неменьи). Сравнение встречаемости микроорганиз­мов оценивали с помощью теста Кохрана. Для обоих тестов использовали поправку на множе­ственные сравнения по Холму. Различия призна­вали статистически значимыми на уровне р<0,05. Для кластеризации результатов анализов для всех временных точек были построены дендрограммы. Для анализа сходства использовали метод Варда (расстояние Брея-Кёртиса).

РЕЗУЛЬТАТЫ

У молодых здоровых и сексуально активных женщин при трехкратном (в течение дня) бакте­риологическом исследовании мочи обнаружено 7 родов ФАБ, дрожжеподобные грибы рода Candida и 10 родов НАБ. ФАБ обнаруживаются в моче всегда во все исследуемые сроки. В этой группе в течение дня доминируют (>60,0%) коагулазо- отрицательные стафилококки (КОС) и Corynebacterium spp. В то же время, большинство других представителей ФАБ встречаются с низкой часто­той (до 20,0%). Таким образом, выделяются под­группы ФАБ с постоянно высокой и низкой ча­стотой обнаружения. Имеет место непостоянное присутствие в моче некоторых ФАБ: Streptococcus spp., S.aureus и Micrococcus spp. (рис. 1). Средний уровень бактериурии для ФАБ составляет утром 10^1,7 КОЕ/мл, днем - 10^1,5 КОЕ/мл, вечером - 10^1,9 КОЕ/мл.

НАБ аналогично ФАБ постоянно присутству­ют в дневной моче. Среди НАБ не выделяются подгруппы по частоте выделения бактерий. Не­которые таксоны НАБ (Eubacterium spp., Pepto- coccus spp., Propionibacterium spp. и Lactobacillus spp.) являются стабильными по частоте выделе­ния в дневной моче, а большинство - имеют не­значительные колебания частоты обнаружения в течение дня (рис. 2). Таким образом, можно говорить об определенном постоянстве частоты обнаружения НАБ в моче. Средний уровень бак­териурии НАБ во все сроки исследования был <10² КОЕ/мл. Исключение составляют Leptospira spp., Bacteroides spp, Fusobacterium spp, уровень бактериурии которых колеблется в пределах 10²­-10⁴ КОЕ/мл.

В соответствии с данными сравнения встре­чаемости микроорганизмов в образцах мочи, взя­той у одних и тех же женщин в разные периоды суток (табл. 1), можно констатировать отсутствие значимых различий в исследуемые сроки для всех микроорганизмов за исключением Veillonella spp. Тем не менее, значимых различий в парных сравнениях для Veillonella spp. не зафиксировано.

Значимые различия (табл. 2) в уровнях бактериурии в течение дня обнаружены только для представителей трех родов (Eubacterium spp., Veillonella spp., КОС). Однако медианные кон­центрации по этим микроорганизмам совпада­ют, за исключением уровня бактериурии для Eubacterium spp. (концентрация в 16:00 в 2 раза выше, чем в 12:00). Тем не менее, ни по одному из этих микроорганизмов значимости в парных сравнениях не зафиксировано.

Несмотря на отсутствие статистически значи­мых отличий по отдельным микроорганизмам, интерес также представляют возможные много­факторные паттерны: суммирование небольших отличий может привести к высокой кластериза­ции (что зависит от величины и направления кор­реляций между микроорганизмами).

Для анализа этого вопросы были построены дендрограммы для кластеризации по спектру (рис. 3) и концентрации (рис. 4) всех рассмотрен­ных микроорганизмов. Однако многофакторные паттерны также не были выявлены. На дендро­граммах присутствуют два кластера, в составе ко­торых практически в равной степени встречаются пробы мочи, взятые во все три промежутка вре­мени у одного и того же человека. Таким образом, уровень подобия результатов трех дневных изме­рений у одной и той же обследуемой достаточно высок. С другой стороны - уровень подобия ми­кробиоты мочи между разными женщинами, не­зависимо от времени взятия у них материала для исследования, относительно низок.

Таким образом, результаты сравнений свиде­тельствуют о том, что существуют незначитель­ные различия в спектре микроорганизмов в моче и уровнях бактериурии у отдельных индивиду­умов в течение дневного времени. Однако в целом у здоровой женщины характерный спектр мочи идентифицируется независимо от дневного вре­мени взятия материала для исследования.

ОБСУЖДЕНИЕ

Существующая стагнация в расшифровке этиологической структуры ИМП заключается в ограниченности стандартного протокола исследо­вания мочи, который предназначен для быстрого обнаружения определенной группы известных уропатогенов, как правило, представителей се­мейства Enterobacteriaceae [10]. Поэтому, призна­вая важность изучения бактериальных сообществ в норме и при различных патологических состоя­ниях, Национальным институтом здоровья США был инициирован «Human microbiome project», который во многом поколебал существующие представления «о стерильности» различных био­топов и расширил знания о микробиоте и микробиоме человека (http://nihroadmap.nih.gov/hmp/, www.human-microbiome.org). На сегодняшний день расширен круг уропатогенов, включающий анаэробные бактерии, для пациентов с симптома­ми поражения нижних мочевых путей [7, 11, 12]. Современные методы идентификации бактерий показали, что 80,0% образцов мочи с отрицатель­ными результатами стандартного исследования содержат широкий паттерн бактерий, в частности Lactobacillus spp., Actinoimyces spp., Corynebacterium spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp. [11]. Получены новые данные о потенциально важных различиях микробиома мочи у женщин с недержанием и без недержания мочи [12]. Все это свидетельствует лишь о том, что многие без­альтернативные постулаты о стерильности мочи, неизменности стандартного бактериологического протокола исследования мочи требуют пересмо­тра. К этой же категории парадигм, на наш взгляд, относится и сбор утренней мочи для проведения бактериологического исследования. Исследова­ние на расширенном наборе питательных сред для аэробных и анаэробных бактерий показало отсутствие значимых отличий для большинства видов. Таким образом, паттерны и концентрации микроорганизмов в моче здоровых женщин в те­чение дня существенно не менялись.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У молодых здоровых сексуально активных женщин при трехкратном бактериологическом исследовании в моче верифицируется широкий паттерн ФАБ и НАБ. Среди ФАБ доминируют коагулазоотрицательные стафилококки и Corynebacterium spp. НАБ являются постоянными ассоциантами микробиоты мочи в течение дня. В группе НАБ доминирующими родами являются Lactobacillus spp., Peptococcus spp., Propionibacterium spp., Eubacterium spp. В течение дня значи­мые различия в частоте обнаружения различных таксонов микроорганизмов отсутствуют за ис­ключением Veillonella spp. Значимые различия в уровнях бактериурии в течение дня обнаруже­ны только для Eubacterium spp., Veillonella spp. и КОС.

Таким образом, частота обнаружения и кон­центрация ФАБ и НАБ в моче являются относи­тельно стабильными показателями. Поэтому бак­териологическое исследование мочи при наличии к нему показаний может производиться в течение дневного времени суток с одинаковой степенью достоверности.