Preview

Нефрология

Расширенный поиск

Диагностический протеомный профиль мочи у пациентов с диабетической нефропатией I стадии при сахарном диабете 2-го типа

Полный текст:

Аннотация

ВВЕДЕНИЕ. Эпидемиология диабетической нефропатии (ДН) при сахарном диабете (СД) 2-го типа изучена недостаточно, время появления ДН определить сложно. ЦЕЛЬ: поиск молекулярных прогностических маркеров ДН 1 стадии у пациентов с СД 2 типа. ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ. Мы верифицировали в исследовании пациентов с СД 2-го типа и ДН 1 стадии (n=42). В контрольную группу включено 30 здоровых лиц. Продолжительность СД составила 5,6 года. На этапе скрининга и сбора данных применялись стандартные методы идентификации ДН. Качественное и количественное молекулярное фенотипирование биообразцов мочи выполнено с помощью методов протеомики («MALDI-TOF-MS/ MS, Ultraflex II», «Bruker», США). Данные о молекулярных взаимодействиях получены с помощью базы данных «STRING 10.0». Статистический анализ выполнен с применением пакета программ «Statistica 12.0» (Statsoft, Россия). РЕЗУЛЬТАТЫ. Мы выявили новые биомаркеры ДН 1 стадии, которые могут быть использованы для создания неинвазивных диагностических тестов образцов мочи. Исследование внутриклеточных сигнальных путей, экспрессии, секреции и накопления молекул в экстрацеллюлярном матриксе является основой для разработки стратегий профилактики ДН.

Для цитирования:


Ибрагимов В.М., Алискандиев А.М., Батюшин М.М., Сарвилина И.В. Диагностический протеомный профиль мочи у пациентов с диабетической нефропатией I стадии при сахарном диабете 2-го типа. Нефрология. 2016;20(5):69-74.

For citation:


Ibragimov V.M., Aliskandiev A.M., Batiushin M.M., Sarvilina I.V. Diagnostic proteomic profile of urine from patients with diabetic nephropathy stage I in diabetes mellitus type 2. Nephrology (Saint-Petersburg). 2016;20(5):69-74. (In Russ.)

ВВЕДЕНИЕ

Одной из главных причин смертности пациен­тов с сахарным диабетом (СД) 2-го типа является диабетическая нефропатия (ДН), которая приво­дит к развитию терминальной почечной недоста­точности [1-5]. В России распространенность ДН при СД 2-го типа в среднем составляет 8%, что ниже мировых показателей в 5 раз. Активное вы­явление пациентов с СД 2-го типа позволяет ду­мать о том, что истинная распространенность ДН в различных регионах России может быть больше в 2-8 раз [2].

Хорошо известно, что ранняя идентификация пациентов, имеющих риск развития ДН, очень важна. Диагностические маркеры, которые се­годня применяются для этого, такие как экскре­ция альбумина с мочой и скорость гломерулярной фильтрации, подвержены существенной вариа­бельности [6], а также имеют невысокую про­гностическую ценность [7]. Точные диагности­ческие методы крайне важны как для разработки мер профилактики ДН, так и для детализации ее интимных механизмов [8]. Моча является интерактомом, который отражает молекулярную информацию о функционировании почек и уро­генитального тракта [9]. Сегодня методы протеомики применяются для оценки профиля пептидов и белков у здоровых субъектов и для сравнения протеома мочи у пациентов с СД с наличием или отсутствием альбуминурии. Пациенты с СД без альбуминурии имеют отличающийся пептидный и белковый паттерн по сравнению с контролем, как и пациенты с альбуминурией демонстрируют индивидуальный полипептидный профиль.

Современные методы и технологии протеом- ного анализа позволяют обнаружить новые про­гностические маркеры и исследовать патологи­ческие пути формирования ДН у пациентов с СД 2-го типа. Сегодня нам необходим прогресс в разработке и клиническом применении новых молекулярных скрининговых тестов, полученных в ходе популяционных исследований и отражаю­щих ключевые геномно-протеомные взаимодей­ствия, которые лежат в основе развития ДН у па­циентов с СД 2-го типа.

Целью настоящего исследования явился поиск диагностического протеомного профиля мочи у пациентов с ДН I стадии (пренефропатия) при СД 2-го типа.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование являлось проспективным когортным сравнительным с параллельным дизай­ном. Исследование выполнено в соответствии с Хельсинской декларацией всемирной медицин­ской ассоциации (1964-2013) и заключением этических комитетов ГБОУ ВПО «Дагестанская государственная медицинская академия» МЗ РФ (г. Махачкала, Россия), ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» МЗ РФ (г. Ростов-на-Дону, Россия).

Обследовали 42 пациента с СД 2-го типа и ДН I стадии (пренефропатия) в соответствии с новой классификации ДН, предложенной Объединенным комитетом по ДН [10]. Критериями включения в исследование были: СД 2-го типа, нормоальбуминурия (альбумин в моче <30 мг/г креатинина), скорость клубочковой фильтрации (СКФ) >30 мл/ мин/1,73 м2. Критерии исключения: микро- или ма­кроальбуминурия, протеинурия, СКФ менее 60 мл/ мин/1,73 м2. Контрольная группа включала 30 прак­тически здоровых лиц. Риски СД 2-го типа были оценены с помощью Финской шкалы оценки ри­сков СД 2-го типа [11]. Продолжительность СД 2-го типа составила 5,6 года, продолжительность тера­пии - 5 лет. Пациенты получали терапию противодиабетическими (глибенкламид, метформин, пиоглитазон, инсулин гларгин), антигипертензивными (амлодипин, валсартан), гиполипидемическими (фенофибрат) препаратами, антиагрегантами.

На этапе скрининга и сбора данных применяли стандартные методы выявления ДН и СД: оценка жалоб пациента, истории болезни, физикального статуса, амбулаторное мониторирование артери­ального давления, ЭКГ («ATES MEDICA», Ита- лия-Россия), УЗИ почек (допплеровский спектр почечных артерий с оценкой эхогенности корти­кального сегмента почек, «SonoAce R3, Samsung Medison», Южная Корея), общеклинический ана­лиз крови и мочи, биохимический анализ крови и мочи («ELISA, Siemens 2000», Германия), оценка компенсации СД 2 типа на основе уровня HbA1c («Randox Laboratories Ltd.», Великобритания), коагулограмма («Instrumentation Laboratory», США), измерение соотношения альбумин/креатинин в моче, оценка функции почек - гломеруляр­ной фильтрации, эффективного почечного крово­тока методом, предложенным H.Bazzak. Характе­ристика групп представлена в табл. 1.

Качественное молекулярное фенотипирова- ние биообразцов (моча) выполняли с помощью методов протеомики: префракционирование, раз­деление белков с помощью стандартных наборов («MB-HIC C8 Kit, MB-IMAC Cu, MB-Wax Kit», «Bruker», США), время-пролетная матриксная масс-спектрометрии с лазерной десорбцией-ио­низацией («MALDI-TOF-MS/MS, Ultraflex II», «Bruker», США). Масс-спектры регистрировали каждые 3 с в диапазоне m/z 350-3000. Отдельные сиквенсы были идентифицированы в системах «BLAST protein-protein» и в базе данных «Swissprot» для раздела «Homo sapiens» с провер­кой идентифицированных белков в базе данных «MASCOT» («Matrix Science», Великобритания). Данные о межмолекулярных взаимодействиях и функциональной активности получены на основе базы данных «STRING 10.0».

Основываясь на данных стандартных мето­дов идентификации ДН и качественного и коли­чественного молекулярного фенотипирования биообразцов мочи, были предложены новые про­гностические маркеры и молекулярные патологи­ческие пути развития пренефропатии у пациентов с СД 2-го типа.

Статистический анализ полученных данных выполнен с помощью пакета программ «Statistica 12.0» («Statsoft», США). Результаты представ­лены в виде среднего арифметического±ошибка средней. Статистическую значимость различий двух средних определяли с помощью t-критерия Стьюдента; частот - х2-критерия Пирсона. Оцен­ку силы взаимосвязи между количественными признаками проводили с помощью коэффициен­та корреляции (r) Пирсона. Нулевую статистиче­скую гипотезу об отсутствии различий и связей отвергали при p<0,05.

 

Таблица 1

Клинико-анамнестическая характеристика пациентов с ДН I стадии и здоровых лиц контрольной группы

Примечание. 1 - контрольная группа; 2n - количество пациентов; 3ИМТ - индекс массы тела, 4СД - сахарный диабет; 5HbA1c - гликозилированный гемоглобин; 6ДН - диабетическая нефропатия; 7Cr - креатинин; 8СГФ - скорость гломерулярной филь­трации; 9JNC7-7 доклад Объединенного Национального Комитета по профилактике, выявлению, оценке и лечению высокого артериального давления (2003); 10САД - систолическое артериальное давление; 11ДАД - диастолическое артериальное дав­ление; различия по t-критерию Стьюдента в группе 1 КГ: ' нет различий; * p<0,05.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

В исследовании мы верифицировали пациен­тов с СД 2-го типа и ДН I стадии (n=42). Клинико­анамнестическая характеристика пациентов с СД 2-го типа и ДН представлена в табл. 1. Параметры коагулограммы, общеклинического анализа кро­ви, уровни мочевой кислоты и калия в сыворотке крови находились в пределах референсных значе­ний у пациентов с СД 2-го типа и ДН i стадии. У 35 пациентов с СД 2-го типа и ДН I стадии выяв­лено достоверное увеличение индексов резистивности для аркуатных или междолевых артерий почек (RI: КГ - 0,60±0,04; группа 1 - 0,81±0,05; p<0,05).

Мы отметили достоверное повышение уров­ней среднего дневного и ночного САД и ДАД, ЧСС (среднее дневное САД: КГ - 115,2±3,1 мм рт. ст., группа 1 - 145,4±4,1 мм рт. ст., p<0,01; среднее дневное ДАД: КГ - 66,7±2,1 мм рт. ст., группа 1 - 82,0±2,8 мм рт. ст., p<0,001; среднее ночное САД: КГ - 115,4±1,8 мм рт. ст., группа 1 - 129,4±2,6 мм рт. ст., p<0,01; среднее ночное ДАД: КГ - 66,8±1,4 мм рт. ст., группа 1 - 81,5±1,7 мм рт. ст., р<0,01; ЧСС: КГ - 79,5±1,3 уд/мин, группа 1 - 85,3±1,5 уд/мин, p<0,05) в группе пациентов с СД 2-го типа и пренефропатией по сравнению с КГ здоровых лиц.

Одновременно выявлена высокая экспрессия пептидов и белков мочи, отражающих прогрес­сирование эпителиально-мезенхимальной транс­формации (ЭМТ) и изменения в экстрацеллюлярном матриксе (ЭМЦ) почек у пациентов с СД 2-го типа и ДН I стадии.

Качественный протеомный анализ способ­ствовал выявлению различий в составе пептидов и белков мочи у пациентов с ДН I стадии в срав­нении с КГ у здоровых лиц. В табл. 2 представ­лен анализ функциональной активности каждого пептида/белка, продемонстрировавший необхо­димость дальнейших исследований и разработки молекулярной патогенетической схемы форми­рования ключевых звеньев ЭМТ и изменений в ЭЦМ почек при ДН в условиях СД 2-го типа.

При биоинформационном анализе были выяв­лены молекулы-участницы универсальных путей возникновения и развития ДН, а также их межмо- лекулярные взаимодействия.

 

Таблица 2

Качественный анализ белкового профиля мочи у пациентов с ДН I стадии и здоровых лиц

Наименование пепти­да/белка

Группа 1 (n1=42)

КГ2 (n=30)

MW2, Да3

Функциональная активность пептида/белка

1

Трансформирующий фактор роста β1

18(φ*4=3,78)

2

44 341

Профибротическая и противовоспалительная актив­ность, регуляция тубулярной ЭМТ5

2

E-кадгерин

22(φ*=5,24)

1

97 456

Регуляция тубулярной ЭМТ; поддержание эпителиальной целостности, клеточного фенотипа; прогрессирование фиброза в почечной ткани

3

Цистатин C

1 5(φ*=3,83)

1

15 799

Ингибитор цистеиновой протеиназы, биомаркер пора­жения гломерулярного аппарата

4

Матриксная металло- протеиназа 9

8(φ*=2,24)

1

78 458

Потенциальный регулятор тубулярной ЭМТ и потери синдеканов

5

NGAL

10(φ*=2,73)

1

22 588

Обеспечивает компенсаторный механизм, противо­стоящий внутриклеточному оксидативному стрессу и комплемент-индуцированному апоптозу

6

Церулоплазмин

12(φ*=3,19)

1

122 205

Биомаркер поражения гломерулярного аппарата

7

Подоцин

23(φ*=5,44)

1

42 201

Поддерживает функциональную целостность клеток, регулируя PI3K/AKT-сигнальный путь

8

Mакрофагальный бе­лок хемоаттракции-1

11 (φ*=2,97)

1

2583

Регулирует активность моноцитов, Т-клеток памяти, NK7-клеток; увеличивает продукцию ФНОа8 и ИЛ-69 в пораженной почечной ткани

Примечание. n1 - количество пациентов с экспрессией пептида/белка; 2КГ - контрольная группа; 3MW - молекулярная масса; 4Дa-дальтон; 5φ* - значения критерия Фишера в группе 1/КГ; 6ЭМТ - эпителиально-мезенхимальная трансформация; 7PI3K/ AKT - внутриклеточный сигнальный путь ферментов фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), киназы AKT; 8NK - естественные киллеры; 9ФНОа - фактор некроза опухоли альфа; 10ИЛ-6 - интерлейкин 6;*** р<0,001, вероятность различий по t-критерию Стьюдента в группе 1/КГ

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные в ходе исследования данные стан­дартных инструментальных и лабораторных ме­тодов исследования не способствовали раннему выявлению ДН у пациентов с СД 2 типа. Каче­ственный и количественный протеомный анализ позволил обнаружить увеличение концентрации пептидов и белков в моче с определенными био­логическими функциями и имеющими различную локализацию в интра- и экстрацеллюлярном про­странствах у пациентов с СД 2-го типа и ДН I ста­дии. Можно думать, что эти изменения отражают типичные морфологические особенности процес­са ЭМТ: утолщение базальных мембран и увели­чение гломерулярного мезангиального матрикса, расширение тубулоинтерстициального простран­ства вследствие увеличения ЭЦМ.

Церулоплазмин, в отличие от альбумина, име­ет более высокие молекулярную массу, отрица­тельный заряд и изоэлектрическую точку 4,4 (кис­лый белок) [12]. Мы предполагаем, что высокая экспрессия церулоплазмина в образцах мочи у пациентов с ДН I стадии в сравнении с контро­лем может быть связана либо с изменением заряда базальной мембраны гломерул, либо вследствие нарушения единства гломерулярного барьера при неизмененной тубулярной функции. Вероятно, церулоплазмин является маркером поражения гломерул почек при ДН в самой ее ранней стадии, но необходимы дальнейшие исследования для подтверждения этого факта.

E-кадгерин экспрессирован в мембране и ци­топлазме почечных тубулярных эпителиальных клеток, и отмечено снижение его синтеза здесь при ДН I стадии по сравнению с контролем. E-кадгерин идентифицирован как маркер, связан­ный с ДН I стадии. Мы выявили высокое содержа­ние в моче цистатина С - маркера тубулярного по­вреждения, связанного с возникновением и даль­нейшим прогрессированием ДН. У здоровых лиц цистатин С свободно фильтруется гломерулами почек и весь реабсорбируется в проксимальных канальцах. Увеличение концентрации цистатина С в моче позволяет считать его маркером почеч­ной тубулярной дисфункции [13,14].

Полученные нами данные подтверждают, что высокая концентрация в моче аутокринных фак­торов, в том числе, ТФР β1, макрофагального фактора хемоаттракции-1 и NGAL, связана с раз­витием ДН. Аутокринная сигнальная сеть может стимулировать формирование гипертрофии клу­бочков, расширения мезангиального матрикса и дистрофии проксимальных канальцев. ТФР β1, который активирует киназу рецептора 1 к ТФР β, фосфорилирует рецептор-регулируемые Smads, Smad2 и Smad3, олигомерный комплекс со Smad4 и таргетную генетическую транскрипцию, вклю­чающую Smad7, рассматривается как ключевой медиатор в патогенезе почечного фиброза [15,16]. Сывороточный NGAL фильтруется через гломерулы и полностью реабсорбируется в проксималь­ных канальцах посредством мультилигандного белкового переносчика мегалина в физиологиче­ских условиях. Поврежденные тубулярные клетки могут активно продуцировать связанный с желатиназой липокалин нейтрофилов в качестве ком­пенсаторного механизма против оксидативного стресса и комплемент-индуцированного апоптоза в клетках. Вероятно, при ДН увеличение концен­трации NGAL в моче является результирующей повреждения в гломерулах и тубулярных клетках. Макрофагальный фактор хемоаттракции-1 регу­лирует миграцию и инфильтрацию моноцитов, Т-лимфоцитов памяти, естественных киллеров (NK) в почечной ткани пациентов с ДН.

Мы обнаружили активацию в моче ММП9. Этот факт может быть связан с эксцессивным ее накоплением в ЭМЦ, что приводит к развитию ДН. MMro ремоделирует ЭМЦ на самых ранних стадиях ДН [17].

Появление в моче специфических белков подоцитов также можно рассматривать в качестве ран­них проявлений ДН. Подоциты помогают поддер­живать гломерулярный фильтрационный барьер и защищают от потери белка. Появление подоцина в моче запускает процесс гломеруло склероза посредством увеличения синехий между подоцитами и базальной мембраной гломерул. Подоцин взаимодействует с PBK/AKT-сигнальным патоло­гическим каскадом, обеспечивая функциональное единство. Каждая молекула белка в функциональ­ной группе взаимодействует с другими молекула­ми белков. Пример межмолекулярных взаимодей­ствий подоцина представлен на рисунке.

 

Схема межмолекулярных взаимодействий подоцина.

NPHS2 - идиопатический стероид-резистентный белок не­фроза 2 (подоцин); NPHS1 - белок нефроза 1, врожденный, финский тип; CD2AP - СЭ2-связанный белок; KIRREL - не- фрин; TRPC6 - член 6-го подсемейства С-рецепторов катионных каналов; NCK2 - адапторный белок NCK 2; FYN­FYN-онкоген, связанный с генами SRC, FGR, YES; KIRREL3 - нефрин 3; NCK1 - адапторный белок NCK1; GRB2 - белок 2, связывающий рецептор фактора роста; PLCG1 - гамма-1 субъединица фосфолипазы C.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы идентифицировали новые биомаркеры ДН I стадии при СД 2-го типа, позволяющие развивать неинвазивные диагностические тесты для мочи с целью раннего выявления патологии. Динамика протеомной карты мочи у пациентов с ДН I стадии помогает детализировать молекулярный механизм возникновения и развития ДН. Исследование сигнальных патологических путей и молекул, синтезируемых, секретируемых и формирующих ЭЦМ, может способствовать разработке новых методов профилактики ДН.

Об авторах

В. М. Ибрагимов
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования, «Дагестанская государственная медицинская академия» МЗ РФ
Россия


А. М. Алискандиев
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования, «Дагестанская государственная медицинская академия» МЗ РФ
Россия


М. М. Батюшин
Ростовский государственный медицинский университет
Россия


И. В. Сарвилина
Медицинский центр «Новомедицина»
Россия


Список литературы

1. International Diabetes Federation, Diabetes Atlas Fifth Edition, International Diabets Federation, Brussels, Belgium, ISSN 1561-6274. Нефрология. 2016. Том 20. №5

2. Шестакова MВ, Шамхалова MШ. Диабетическая нефропатия: клиника, диагностика, терапия / Под ред. ИИ Дедова М., 2009: 27

3. Смирнов АВ, Добронравов ВА, Кисина ААидр. Клинические рекомендации по диагностике и лечению диабетической нефропатии. Нефрология 2015; 19(1): 67-77

4. Shlipak M. Diabetic nephropathy. BMJ Clin Evid 2009; 06.06.

5. KDOQI Clinical Practice Guideline for Diabetes and CKD: 2012 Update. Am J Kidney Dis 2012; 60(5):850-886

6. Smulders X Slaats E, Rakic M et al. Short-term variability and sampling distribution of various parameters of urinary albumin excretion in patients with non-insulin-dependent diabetes mellitus. J Lab Clin Med 1998;132:39-46

7. T. Fiseha Urinary biomarkers for early diabetic nephropathy in type 2 diabetic patients. Biomark Res 2015; 3:16-21

8. Alkhalaf A, Zurbig P, Bakker S et al. For the PREDICTIONS Group «Multicentric Validation of Proteomic Biomarkers in Urine Specific for Diabetic Nephropathy». PLoS ONE 2010; 5(10):13421

9. Гасанов МЗ, Батюшин ММ, Терентьев ВП, Садовничая НА. Протеомное исследование мочи у пациентов с гломеурлонефритом и раком почки. Нефрология 2013;5:75-82 [Gasanov MZ, Batiushin MM, Terent'ev VP, Sadovnichaia NA. Proteomnoe issledovanie mochi u patcientov s glomeurlonefritom i rakom pochki. Nefrologiia 2013;5:75-82]

10. Haneda M, Utsunomiya K, Koya D et al. Joint Committee on Diabetic Nephropathy. A new Classification of Diabetic Nephropathy 2014: a report from Joint Committee on Diabetic Nephropathy. J. Diabetes Investig 2015; 6(2):242-246

11. Lindström J, Tuomilehto J. The diabetes risk score: a practical tool to predict type 2 diabetes risk. Diabetes Care 2003; 26 (3):725-731

12. Yamazaki M, Ito S, Usami A et al. Urinary excretion rate of ceruloplasmin in non-insulin-dependent diabetic patients with different stages of nephropathy. Eur J Endocrinol 1995; 132: 681-687

13. Randers E, Erlandsen E, Pedersen O et al. Serum cystatin C as an endogenous parameter of the renal function in patients with normal to moderately impaired kidney function. Clin Nephrol 2000; 54:203-209

14. Kim S, Song S, Kim I, Jeon Y Urinary Cystatin C and Tubular Proteinuria Predict Progression of Diabetic Nephropathy. Diabetes Care 2013; 36(3): 656-661

15. Miyazono K. TGF-beta signaling by Smad proteins. Cytokine Growth Factor Rev 2000; 11(1-2):15-22

16. Shaker O, Sadik N. Transforming growth factor beta 1 and monocyte chemoattractant protein-1 as prognostic markers of diabetic nephropathy. Hum Exp Toxicol 2013; 32(10):1089-1096

17. Kolset S, Reinholt F, Jenssen T. Diabetic Nephropathy and Extracellular Matrix. J Histochem Cytochem 2012; 60(12): 976-986


Для цитирования:


Ибрагимов В.М., Алискандиев А.М., Батюшин М.М., Сарвилина И.В. Диагностический протеомный профиль мочи у пациентов с диабетической нефропатией I стадии при сахарном диабете 2-го типа. Нефрология. 2016;20(5):69-74.

For citation:


Ibragimov V.M., Aliskandiev A.M., Batiushin M.M., Sarvilina I.V. Diagnostic proteomic profile of urine from patients with diabetic nephropathy stage I in diabetes mellitus type 2. Nephrology (Saint-Petersburg). 2016;20(5):69-74. (In Russ.)

Просмотров: 145


ISSN 1561-6274 (Print)
ISSN 2541-9439 (Online)