СУБПОПУЛЯЦИИ ИММУННЫХ КЛЕТОК ПРИ ГЛОМЕРУЛИТЕ АЛЛОГРАФТА ПОЧКИ: СОСТАВ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Долгосрочная выживаемость аллографта почки (АП) все еще остается низкой, главным образом в связи с развитием иммунологического конфликта между организмом реципиента и донорским орга­ном - реакцией отторжения АП [1-3]. Одним из проявлений отторжения является гломерулит [4] - микроваскулярное воспаление (МВВ) АП в виде интрагломерулярной аккумуляции мононуклеар- ных клеток с окклюзией ими капиллярных петель клубочка [5]. По современным международным критериям Banff гломерулит рассматривается как признак антительно-опосредованного отторжения (AMR, antibody mediated rejection) [4], в контексте которого его развитие опосредованно связывани­ем донор-специфических антител (ДСА) с анти­генами эндотелия микрососудов трансплантата [6-8]. С позиции AMR достаточно полно изучен клеточный состав инфильтратов в клубочке при гломерулите, который может быть представлен разнообразными иммунными клетками [9-13] с преобладанием моноцитарно-макрофагальных клеток (М/Мф) [10-14]. Однако гломерулит мо­жет присутствовать и без ДСА: в сочетании с морфологическими признаками Т-клеточного от­торжения (TCMR, T-cell mediated rejection) или при отсутствии каких-либо других признаков иммунологического конфликта [14-18]. Установ­лено, что такие фенотипы гломерулита являются независимыми предикторами потери АП [15, 17, 19, 20]. Но механизмы развития гломерулита при отсутствии ДСА, а также субпопуляционный со­став иммунных клеток, участвующих в формиро­вании такого фенотипа отторжения, изучены на настоящий момент недостаточно. Целью данного исследования было определение состава субпопу­ляций иммунных клеток в клубочке при разных фенотипах гломерулита и его связи с отдаленным прогнозом аллотрансплантации почки (АТП).

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследуемая группа пациентов

В ретроспективное обсервационное исследо­вание были включены 97 реципиентов АП, полу­чивших трансплантат в 2000-2013 гг. Пациенты соответствовали следующим критериям включе­ния: наличие в индикационной или протоколь­ной биопсии гломерулита в соответствии с кри­териями Banff [5], совместимость с донором по группе крови, отрицательный цитотоксический кросс-матч тест. Критериями исключения были: морфологические признаки возврата первичной почечной патологии, полиома-вирусная инфекция (подтвержденная иммуногистохимически), ча­стые рецидивирующие инфекции мочевого тракта после АТП. Основные клинико-демографические показатели представлены в табл. 1. У всех паци­ентов оценивали СКФ по формуле MDRD на мо­мент биопсии с гломерулитом.

Морфологический и иммунологический анализ

Пациентам были определены ДСА на момент биопсии с гломерулитом, методы иммунологиче­ского и морфологического анализа описаны ра­нее [19]. На основании наличия/отсутствия ДСА пациенты были разделены на подгруппы: ДСА+ (n=25), ДСА- (n=53). В 19 случаях на момент биопсии определение ДСА было невозможным (ДСА?) в связи с техническими ограничениями.

Медиана от АТП до биопсии с гломерулитом со­ставила 35 (9; 155) дней. Оценивали морфологи­ческие параметры в соответствии с критериями Banff (табл. 2), а также наличие/отсутствие сопут­ствующей инфильтрации клубочков нейтрофила- ми. В 18% (n=17) случаев гломерулит был выявлен в раннем посттрансплантационном периоде (до 7 дней включительно), в том числе у 9 реципиентов подгруппы ДСА- и четырех - подгруппы ДСА+. В последующих биопсиях оценивали персистенцию и/или рецидивы гломерулита, развитие гломерулопатии (ГП).

Иммуногистохимический анализ СВ+-клеток

Для идентификации иммунных клеток иммуногистохимические (ИГХ) реакции прово­дили на парафиновых срезах, фиксированных формальдегидом, после регидратации и дема­скирования антигенов по стандартной методике. ИГХ-окрашивание проводили с использованием первичных моноклональных мышиных антител, специфичных к CD68+ (маркер моноцитарно- макрофагальных клеток), CD3+ (маркер Т-лимфоцитов), CD20+ (маркер В-лимфоцитов) и вторичных антител к иммуноглобулинам мыши, коньюгированных с пероксидазой (для образцов, окрашенных на CD68+-антигены) или с щелочной фосфатазой (для образцов, окрашенных на CD3+- и CD20+-антигены). Визуализацию окрашенных на CD-маркеры и отсканированных биоптатов проводили с помощью программы Pannoramic Viewer (3D HISTECH Ltd.). Для количественной оценки гломерулярных инфильтратов рассчи­тывали среднее число CD68+-, CD3+- и CD20+- клеток на клубочек.

Иммуносупрессивная терапия, период на­блюдения и исходы

Случаи гломерулита с ДСА+ были расценены как AMR, в связи с чем проводили соответствую­щую иммуносупрессивную терапию (ИСТ), под­робно описанную ранее [19]. Тактика ИСТ, при­мененная при гломерулите с ДСА-/ДСА?, также изложена в предыдущих работах [19, 21].

Медиана периода наблюдения от биопсии со­ставила 51 (8; 72) мес. Комбинированная конечная точка включала в себя два исхода: полную потерю АП с возвратом на диализ или СКФ по формуле MDRD < 15 мл/мин/1,73 м².

Статистический анализ

Для анализа различий между оцениваемыми параметрами в группах применяли непараме­трический критерий Манна-Уитни, точный тест Фишера и критерий χ² Пирсона при анализе та­блиц сопряженности. Анализ выживаемости АП производили с помощью метода Каплана-Майе­ра. Дату смертельного исхода, наступившего при наличии функционирующего АП, учитывали как конец наблюдения, а такой случай как цен­зурированный. Для выявления различий между кривыми выживаемости использовали Log-rank тест. Регрессионный анализ Кокса применяли для оценки прогностической значимости изучаемых факторов с коррекцией по другим потенциальным факторам риска потери АП путем их принуди­тельного включения в анализ. В мультивариантные регрессионные модели включали показатели, которые имели связь с риском потери АП в одно­вариантном анализе при p < 0,1.

Данные представлены как среднее и стандартное отклонение (M±SD), медиана с интерквартильным размахом (m, 25-75%). Критический уровень значимости для всех статистических те­стов и коэффициентов регрессии принимали рав­ным 0,05. Для статистической обработки данных использовали пакеты прикладных статистических программ SPSS for Windows 23.0 (IBM Chicago, IL, USA), Statistica 12.0 (StatSoft Inc., USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Клеточный состав гломерулярных инфиль­тратов

В клубочках преобладали CD68+-клетки, ме­диана составила 4 (2; 8) клетки на клубочек, а также CD3+-клетки, медиана - 3 (1; 7) клетки на клубочек. CD20+-клетки в клубочках были выяв­лены в 74% случаев, из них в 90% среднее зна­чение уровня CD20+-клеток не превышало 1 на клубочек.

При сравнении степени инфильтрации CD+- клетками клубочков между подгруппами ДСА+ и ДСА- различия были выявлены только в уровне CD68+-клеток (рис. 1).

В 59% биопсий, помимо инфильтрации капил­ляров клубочка мононуклеарными клетками, на­блюдалась сопутствующая инфильтрация клубоч­ков нейтрофилами. В подгруппе с ДСА- нейтрофилы были обнаружены в 57% биопсий, в ДСА+ - в 72% (р > 0,05).

Морфологические исходы и уровень интрагломерулярных клеток

В последующих биопсиях рецидивы и/или персистенция гломерулита были выявлены в 35% всех случаев, в подгруппе ДСА- и ДСА+ - в 30 и 50% случаев соответственно. Развитие ГП в по­следующих биопсиях выявили в 23 и 15% случаев в подгруппах ДСА+ и ДСА- соответственно. В 9 случаях ГП была обнаружена на момент первой биопсии с гломерулитом. Подгруппы ДСА+ и ДСА- достоверно не отличались по частоте раз­вития ГП, рецидивам и/или персистенции гломе- рулита (p > 0,05). Среди случаев гломерулита в раннем посттрансплантационном периоде также наблюдали его рецидивы/персистенцию (ДСА- - n = 7, ДСА+ - n = 2) и развитие ГП (n = 3, все случаи ДСА-).

Уровень CD68+-клеток ≥ 8 на клубочек имел достоверную прямую связь с наличием рецидивов/персистенцией гломерулита (ОШ = 7,50; ДИ для 95% 2,49-22,60, p < 0,001) и развитием ГП (ОШ = 4,83; ДИ для 95% 1,40-16,65, p = 0,013) в отличие от CD3+- и CD20+-клеток (р > 0,05).

Анализ выживаемости

Достоверные отличия выживаемости АП были выявлены при сравнении групп с различной сте­пенью инфильтрации CD68+-клетками клубоч­ков. Уровень CD68+-клеток больше 8 на клубочек был ассоциирован со снижением выживаемости АП, как и наличие более 1 СD3+-клетки (рис. 2, А, Б). Выживаемость АП не отличалась при на­личии/отсутствии CD20+ в клубочках (рис. 2, В). При сочетании инфильтрации CD8+-клетками > 8 на клубочек с наличием ДСА выживаемость АП была достоверно ниже (рис. 2, Г).

Унивариантный регрессионный анализ Кок­са показал, что относительный риск потери АП достоверно возрастает при увеличении уровня CD68+-клеток в клубочке, наличии ДСА, увели­чении времени холодовой и тепловой ишемии (табл. 3).

В мультивариантных моделях уровень CD68+ клеток в клубочках имел достоверную связь с негативным прогнозом АТП при коррекции по другим показателям, представленным в табл. 4. Увеличение степени инфильтрации микрососудов клубочка на 1 СВ68+-клетку на клубочек было ас­социировано с повышением относительного ри­ска потери АП на 5-7% (p<0,005) (табл. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ

Субпопуляционный состав иммунных кле­ток в клубочках при отторжении АП подвергал­ся изучению во многих исследованиях [9-13], в которых основное внимание отводилось клеткам моноцитарно-макрофагального ряда как неотъем­лемому звену активации гуморального иммунитета [22, 23]. В этой связи подавляющая часть иммуно- морфологических исследований в данной области выполнена в группах больных с преимуществен­но антительно-опосредованным отторжением АП [9-12]. Связь микроваскулярного воспаления клу­бочков со снижением выживаемости АП при нали­чии ДСА хорошо известна. Недавно показано, что гломерулит в отсутствие ДСА (изолированный гломерулит) также ассоциирован с неблагоприятным прогнозом АТП [19]. Исследования прогностиче­ского значения состава иммунных клеток в клу­бочках при таком типе морфологического повреж­дения до настоящего времени были представлены единичными публикациями [13].

Нами закономерно подтверждены полученные ранее данные о наличии ассоциации моноцитарно-макрофагальной инфильтрации капиллярных пе­тель клубочка с признаками AMR - ДСА, C4d, ГП [10-12]. Так, у пациентов с позитивными ДСА на момент биопсии уровень СБ68+-клеток был до­стоверно выше, чем у пациентов с отрицательны­ми ДСА (см. рис. 1), кроме того, уровень CD68+ имел прямую связь с развитием ГП в последую­щих биопсиях. Ранее было установлено, что уро­вень CD68+ в клубочках связан с выживаемостью

АП [11, 12, 24]. Эти исследования включали гете­рогенные группы случаев с различными видами отторжения, с наличием и отсутствием гломерулита. В представленном исследовании, где были изучены субпопуляции иммунных клеток при гло- мерулите АП, выживаемость была ниже при уве­личении числа М/Мф и Т-лимфоцитов в клубоч­ках (рис. 2А, 2Б). Степень инфильтрации клубоч­ка Т- или В-лимфоцитами не была ассоциирована с прогнозом АТП. Вместе с тем, впервые установ­лено, что уровень СD68+-клеток в клубочках при гломерулите является независимым предиктором долгосрочной выживаемости АП при коррекции по другим существенным морфологическим и клиническим показателям. С позиций патогене­за данное наблюдение указывает на негативную роль аккумуляции М/Мф в гломерулярном по­вреждении аллографта почки.

Механизмы инфильтрации капилляров АП моноцитарно-макрофагальными клетками под­вергались изучению в экспериментальных и клинических моделях AMR в отличие от ДСА- негативного варианта микроваскулярного воспа­ления клубочков АП. Эти механизмы включают антительно-опосредованную индукцию экспрес­сии адгезионных молекул (P-селектин, intercellu­lar adhesion molecule 1, vascular cell adhesion mole­cule 1) и хемоаттрактантов (monocyte chemoattrac- tant protein 1, macrophage inflammatory proteins, macrophage migration inhibitory factor) [25-28] в эндотелии, что приводит к миграции моноцитов в микрососуды и их активации при взаимодействии Fcγ-рецепторов с Fc-фрагментами ДСА [25, 29, 30]. Повреждение может осуществляться через интерлейкины-1, -6, -12, интерферон-γ, фактор некроза опухоли-α, экспрессируемые активиро­ванными М/Мф [26, 31, 32]. Кроме того, не ис­ключено участие M/Мф в повреждении АП через механизмы антительно-зависимой клеточной ци­тотоксичности [32, 33].

В исследованной группе у большинства боль­ных (54,6%) ДСА на момент диагностики гломе- рулита отсутствовали, а в клубочках преобладали CD68+-клетки, наряду с CD3+-лимфоцитами. Ме­ханизмы формирования интракапиллярного вос­паления клубочка при отсутствии ДСА остаются недетализированными. Полученные данные по­зволяют предполагать некоторые вероятные пути развития этого отдельного фенотипа иммунного повреждения АП.

Развитие интракапиллярной инфильтрации в раннем периоде после АТП в 18% изученных слу­чаев можно было бы объяснить реперфузионным повреждением, роль М/Мф в развитии которого показана в экспериментальных исследованиях [34-37]. В то же время, продемонстрирована бо­лее выраженная М/Мф-реакция при аллогенной трансплантации, где присутствуют и реперфузи- онное повреждение, и иммунный ответ по сравне­нию с сингенной [38]. Установлено, что в случае первой CD68+-клетки могут распознавать аллоан­тигены трансплантата, что приводит к активации М/Мф с последующей инициацией ими специфи­ческого иммунного ответа через представление антигенов Т-лимфоцитам [39]. В анализируемой группе в клубочках в той или иной степени одно­временно присутствовали и CD68+-, и CD3+- клетки. Кроме того, у пациентов с инфильтраци­ей CD68+-клетками клубочков в раннем периоде после АТП в последующих биопсиях также вы­являли гломерулит, в части случаев развилась гло- мерулопатия, что свидетельствует о персистенции воспалительной реакции в микрососудах. Оче­видно, что CD68+-инфильтрация клубочка в ран­нем периоде после АТП не является исключитель­но следствием реперфузионного повреждения, а в большей степени связана с начальными этапами иммунного ответа, в котором триггером может быть ишемия-реперфузия.

Другой механизм развития изолирован­ного гломерулита может быть опосредован CD14+CD16++-субпопуляцией моноцитов в капиллярах [40]. В отсутствие воспаления эта субпопуляция конститутивно патрулирует лю- минальную поверхность эндотелия микрососу­дов почки [40, 41]. В активации CD14+CD16++- моноцитов могут участвовать лиганды некоторых Toll-подобных рецепторов этих клеток, а также CD4+-лимфоциты после распознавания антиге­нов сосудистой стенки [40-43]. После активации CD14+CD16++-моноциты рекрутируют нейтро- филы, которые повреждают эндотелиальные клет­ки, синтезируя ROS (reactive oxygen species), что может приводить к некрозу последних [40-42]. Ранее было выявлено, что после АТП у реципиен­тов происходит увеличение уровня активирован­ных CD14+CD16++-моноцитов в кровотоке, что подтверждает возможность их активации [44]. По-видимому, описанный механизм является уни­версальным, поскольку вовлечен в повреждение почки при различных патологиях, не ограничи­ваясь случаями АТП [40, 45, 46]. В случае изоли­рованного гломерулита нейтрофильная реакция в сочетании с М/Мф в микрососудах клубочка была выявлена нами более чем в половине случаев, что может являться следствием вышеописанного ме­ханизма. С другой стороны - разнообразие кле­точного состава при МВВ (М/Мф, нейтрофилы и Т-лимфоциты) может определяться характером экспрессии специфичных для иммунных клеток молекул адгезии активированным эндотелием в зависимости от степени повреждения эндотелио- цитов [40] и баланса про- и антиапоптотических факторов в этой клеточной популяции [47].

Другой эндотелий-опосредованный меха­низм развития гломерулита при отсутствии ДСА может быть опосредован в том числе антиген- представляющими свойствами эндотелиоцита. Повреждающими факторами в этом случае, веро­ятно, могут быть предсуществующие или de novo не-HLA-аутоантитела (angiotensin II type 1 receptor [48-51], endothelin-1 type A receptor [52], endoglin [53], perlecan [54], EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3 [53], Fms-like tyrosine kinase-3 [53], intercellular adhesion molecule 4 [53]) к антигенам эндотелия. Показано, что наличие предсуществующих аутоантител к эндотелиальным антигенам ассоциировано с развитием морфологических признаков, напоминающих AMR, включая гломерулит [48-50], и снижением выживаемости АП в отсутствие HLA-антител [50, 51]. В условиях раз­личных пертурбаций, например, при ишемии-ре­перфузии, токсическом действии ИСТ и других препаратов, гломерулярной гиперфильтрации, оксидативном стрессе, действии компонентов ренин-ангиотензиновой системы, возможно по­вышение экспрессии аутоантигенов на эндотелии [54-56] и высвобождение экстрацеллюлярных ве­зикул, в том числе апоптотических тел, содержа­щих различные аутоантигены [57]. Это, с одной стороны, может приводить к синтезу аутоантител de novo [58], с другой - к активации предсуще- ствующими аутоантителами эндотелиальных кле­ток [53, 54, 56] с увеличением экспрессии в них HLA I, молекул адгезии и хемокинов (P-селектин, intercellular adhesion molecule 1, сhemokine ligand 5, resistin) [53]. Последнее, в свою очередь, может способствовать адгезии к эндотелию воспали­тельных клеток - М/Мф, Т-лимфоцитов. М/Мф способны в дальнейшем распознавать аллоанти­гены и действовать как антиген-презентирующие клетки (АПК) [39]. Как АПК функционируют и активированные эндотелиальные клетки, презен- тируя аллоантигены CD8+ Т-лимфоцитам с даль­нейшим развитием апоптоза эндотелиоцитов [59, 60]. Кроме того, распознавание аутоспецифич­ными CD4+ T-лимфоцитами эндотелиальных ау­тоантигенов может приводить к рекрутированию патрулирующих моноцитов и нейтрофилов [41].

Можно предположить, что в зависимости от свойств аутоантител, баланса про- и антиапоптотических факторов в эндотелиальных клетках, особенностей регуляции В-клеточного ответа возможно разрешение воспалительной реакции в микрососудах, а в некоторых случаях - перси- стенция воспаления с развитием необратимого повреждения клубочков [61]. Кроме того, такая персистирующая аутоиммунная реакция может способствовать развитию аллоиммунной [62, 63], а маркером такой персистенции может быть коли­чество М/Мф в сосудах.

Нельзя и полностью исключить антительно-опосредованный механизм М/Мф-инфильтрации клубочка в случае изолированного гломерулита АП. В части случаев возможно наличие недетек­тируемых в системной циркуляции ДСА в резуль­тате их локального синтеза [64, 65] и/или специ­фической адсорбции в аллографте [66-68]. Воз­можно, что в таких ситуациях первичными в раз­витии аллоиммунного механизма будут являться эндотелий-опосредованные иммунные реакции.

В развитии МВВ могут участвовать антиэндотелиальные аутоантитела [48-53], определение которых мы рутинно не выполняли, что следует отнести к ограничениям исследования, как и его ретроспективный характер. Вместе с тем, к пре­имуществам исследования можно отнести дли­тельные сроки наблюдения, представительную группу пациентов, селекционированных по нали­чию гломерулита, значительную долю его «изоли­рованного» фенотипа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, гломерулит, неблагоприятный фенотип иммунного повреждения АП, может быть опосредован реализацией разных механизмов, что требует дальнейшего изучения патогенеза и подходов к терапии. Определение субпопуляций иммунных клеток при гломерулите, в частности

CD68+, представляется важным для оценки про­гноза АТП и более точной стратификации групп риска.