Preview

Нефрология

Расширенный поиск

ЦИТОПРОТЕКТОРНЫЙ ЭФФЕКТ АЛЬФА-1 КИСЛОГО ГЛИКОПРОТЕИНА НА МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО РЕПЕРФУЗИОННОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧКИ

https://doi.org/10.24884/1561-6274-2018-22-1-91-97

Полный текст:

Аннотация

На экспериментальной модели реперфузионного повреждения почки (Kidney Ischemia-Reperfusion – K I/R) была  изучена специфическая  фармакологическая  активность препарата «Орозин», действующим веществом которого является альфа-1 кислый гликопротеин. В качестве референтного препарата был выбран «Актовегин».  Цель  работы – изучение цитопротекторного эффекта  препарата  «Орозин» на модели экспериментальной ишемии–реперфузии почек. Половозрелым самцам крыс  линии  Wistar проводили правостороннюю нефрэктомию с последующим механическим пережатием сосудистого пучка левой почки в течение 45 мин и дальнейшей реперфузией. Препараты вводили внутривенно, в два  этапа: за 10 мин до освобождения от механического пережатия сосудистого пучка почки и через 30 мин после реперфузии. В качестве критериев эффективности действия препарата оценивали биохимические показатели крови  – уровень креатинина и мочевины, а также  проводили гистологическое исследование ткани  почек  через 2 и 24 ч после реперфузии. В результате исследования экспериментальной модели острой почечной недостаточности было выявлено наличие цитопротекторного действия препарата «Орозин», подтвержденного биохимическими и гистологическими исследованиями.

Для цитирования:


Ванатиев Г.В., Буренков П.В., Лютов А.Г., Ковалева М.А., Макарова М.Н., Макаров В.Г. ЦИТОПРОТЕКТОРНЫЙ ЭФФЕКТ АЛЬФА-1 КИСЛОГО ГЛИКОПРОТЕИНА НА МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО РЕПЕРФУЗИОННОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧКИ. Нефрология. 2018;22(1):91-97. https://doi.org/10.24884/1561-6274-2018-22-1-91-97

For citation:


Vanatiev V.G., Burenkov P.V., Lutov A.G., Kovaleva M.A., Makarova М.N., Makarov V.G. CYTOPROTECTIVE EFFECT OF ALPHA-1 ACID GLYCOPROTEIN ON THE EXPERIMENTAL MODEL OF RENAL REPERFUSION INJURY. Nephrology (Saint-Petersburg). 2018;22(1):91-97. (In Russ.) https://doi.org/10.24884/1561-6274-2018-22-1-91-97

ВВЕДЕНИЕ

Острое повреждение почек (ОПП) имеет важ­ное значение не только в краткосрочной, но и в долгосрочной перспективе. Частота ОПН в от­делениях интенсивной терапии составляет от 5 до 15% [1]. При этом, у 5% пациентов для ее коррекции было необходимо проведение заме­стительной почечной терапии (ЗПТ) [2]. Влияние ЗПТ изменяет течение ОПП, однако, несмотря на это, даже в ведущих клиниках всего мира, леталь­ность сохраняется на уровне 55-75% и не снижается в течение последних десятилетий [3, 4]. В клинической практике самой частой формой ОПП является преренальная форма (50-75%), которая характеризуется фазностью течения: период ги­поперфузии (ишемии) сменяется периодом репер­фузии [5]. Это требует обязательного мониторин­га ряда показателей и адекватной коррекции вы­являемых изменений. Однако серьезной задачей остается поиск и тестирование новых лекарствен­ных средств, которые могут быть использованы не только с леченбными, но и профилактическими целями.

Альфа-1 кислый гликопротеин (АГП) являет­ся одним из главных представителей семейства острофазовых белков. Концентрация АГП повы­шается при многих патологических состояниях, в частности, при острых нарушениях кровообра­щения [6, 7], травмах и краш-синдроме [8]. Из­мерение его концентрации в крови в клинической практике в настоящее время используется в каче­стве диагностического и прогностического кри­терия. Показано, что АГП участвует в регуляции проницаемости сосудистой стенки, реологиче­ских свойств крови, течения воспалительных про­цессов, а также выступает как фактор, повышаю­щий неспецифическую резистентность организма [9, 10]. Исследование эффективности фармако­логических препаратов, улучшающих микроцир­куляцию за счет воздействия на реологические свойства крови и состояние микроциркуляторного русла, является перспективным направлением лечения острой дисфункции почек.

Целью данной работы являлось выявление специфической фармакологической активности препарата «Орозин» в условиях эксперименталь­ной модели реперфузионного повреждения почек.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

План исследования был рассмотрен на засе­дании и одобрен к проведению. Исследование одобрено биоэтической комиссией ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации» и проведе­но на 112 крысах-самцах линии Wistar с массой тела 250-300 г, которые содержались в стандарт­ных условиях вивария в ходе периода адаптации и последующего эксперимента. При выборе доз руководствовались литературными данными о те­рапевтических дозах изучаемых препаратов.

«Орозин» был протестирован в условиях экс­периментальной ишемии-реперфузии в трех до­зах: 233, 466 и 700 мг/кг, что соответствует 1/3 ВТД (высшая терапевтическая доза), 2/3 ВТД и 1 ВТД. В качестве референтного препарата был ис­пользован антигипоксант «Актовегин» [11] в дозе 80 мг/кг, что составляет 1 ВТД для крысы.

Экспериментальное реперфузионное повреж­дение почки моделировали по методу H. Rabb (1995) [12]. В соответствии с методикой в экс­перименте участвовали: интактная группа - без моделирования патологии; ложнооперированная группа - только лапаротомия; контрольная груп­па - моделирование патологии. Для формиро­вания патологии животное погружали в наркоз («Золетил 100», 2,6 мг/кг) и «Ксилазин» (2,6 мг/ кг, при внутривенном введении), после чего фик­сировали на операционном столике. Далее прово­дили срединную лапаротомию, визуализировали правую почку животного, на её сосудистый пучок накладывали две перманентные лигатуры и по­средством пересечения сосудистого пучка между лигатурами проводили правостороннюю нефроэктомию. После правосторонней нефроэктомии визуализировали левую почку животного и ише­мизировали её путем наложения атравматичного зажима на её сосудистый пучок на 45 мин. После начала периода ишемии капсула почки приоб­ретала серый оттенок. После 45 минут ишемии производили реперфузию путем удаления зажи­ма. Сразу после начала реперфузии отмечали по­краснение капсулы почек, что свидетельствовало о восстановлении кровообращения органа. Далее послеоперационная рана была послойно ушита, шов - обработан антисептиком. Препараты вво­дили внутривенно, в два этапа: за 10 мин до осво­бождения от механического пережатия сосудисто­го пучка почки и через 30 мин после реперфузии.

Эвтаназию 50% особей каждой эксперимен­тальной группы проводили через 2 ч после нача­ла реперфузии, оставшихся особей - через 24 ч. Во время эвтаназии производили забор венозной крови для оценки уровня креатинина и мочевины путем стерильного обескровливания из полостей сердца. Биохимические показатели крови опре­деляли на биохимическом анализаторе «А-25» (Испания) с использованием реагентов фирмы «BioSystems» (Испания) в пробах сыворотки кро­ви без следов гемолиза.

В процессе некропсии вычленяли левую почку у каждого животного, затем фиксировали в 10% растворе забуференного формалина. Материал для гистологического исследования фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в тече­ние 24 ч, после чего по общепринятой методике заливали в парафин. Затем изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематок­силином и эозином. Морфологическое исследо­вание гистологических препаратов проводилось при помощи светооптического микроскопа «Carl Zeiss» (Германия). Критериями гистологической оценки служили: наличие поражения клубочков, канальцев, воспалительной инфильтрации и не­кроза.

Для оценки результатов исследования ис­пользовали пакет прикладных статистических программ «Statistica 10.0» («StatSoft», США). Результаты представлены в виде среднего ариф­метического ± ошибка средней. Статистическую значимость различий двух средних определяли с помощью t-критерия Стьюдента; частот - χ2- критерия Пирсона. Нулевую статистическую ги­потезу об отсутствии различий и связей отвергали при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В ходе проведения анализа данных, получен­ных через 2 ч после начала реперфузии, было выявлено достоверное увеличение уровня креа- тинина и мочевины в крови животных экспери­ментальных групп по сравнению с показателями интактной и ложнооперированной групп.

На рис. 1, 2 представлены данные по влиянию исследуемых препаратов на концентрации креатинина и мочевины через 24 ч после начала ре­перфузии.

Анализ данных, полученных через 24 ч по­сле реперфузии, выявил достоверное увеличение уровней креатинина и мочевины эксперименталь­ных групп, которым было проведено моделирова­ние патологии в отличие от интактной и ложноо- перированной групп. При этом уровень креатинина и мочевины в группах, получавших иссле­дуемые препараты, был достоверно ниже уровня таковых показателей контрольной группы.

Уровни креатинина и мочевины после введе­ния «Орозина» были ниже на 76 и 39% соответ­ственно по отношению к концентрациям изучае­мых показателей крови в контрольной группе че­рез 24 ч после моделирования экспериментальной патологии. В группах, получавших «Орозин», не было отмечено достоверных различий по эффек­тивности исследованных доз препарата, что гово­рит о широте его терапевтического действия. Ана­логичный эффект оказал и «Актовегин» - на фоне его введения отмечали снижение уровня креати­нина на 69% и мочевины на 24%. На основании этого был сделан вывод о наличии нефропротек- торного действия у исследуемых препаратов.

У животных после воспроизведения патоло­гии отмечали набухание эпителия с увеличением объема клеток, а также исчезновение щеточной каймы, явления кариопикноза, отслоение клеток от базальной мембраны, их атрофию. Формиро­валась «щитовидная почка» с расширением ка­нальцев, уплощением эпителия, ядра клеток ста­новились мелкими, гиперхромными, в просвете канальцев скапливались эозинофильные гиалиноподобные массы. Крайней степенью поражения являлись некрозы, от локальных, захватывающих небольшие участки, до обширных - глубоких, с некрозами не только канальцев, но и клубочков. Выраженность патологии зависела от группы, но не зависела от времени эвтаназии животных.

 

Рис. 1. Уровень креатинина крови животных через 24 ч после начала реперфузии. * Отличия статистически значимы в срав­нении с интактной группой, р<0,05, критерий Тьюки. # Отличия статистически значимы в сравнении с контрольной группой, р<0,05, критерий Тьюки.

 

Рис. 2. Уровень мочевины крови животных через 24 ч по­сле начала реперфузии. * Отличия статистически значимы в сравнении с интактной группой, р<0,05, критерий Тьюки. # Отличия статистически значимы в сравнении с контрольной группой, р<0,05, критерий Тьюки.

 

 

Рис. 3. Срез почки крысы контрольной группы, эвтанази- рованной через 2 ч после реперфузии. Значительная часть канальцев расширены с уплощенным дистрофичным эпи­телием, ядра частично с кариорексисом. Поражение более 2/3 канальцев. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.100.

 

 

Рис. 4. Срез почки крысы контрольной группы, эвтаназиро­ванной через 24 ч после реперфузии. Массивный некроз с поражением клубочков. Поражение в виде некроза и вос­палительной инфильтрации. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.100.

 

 

Рис. 5. Срез почки крысы, получавшей «Орозин» в дозе 446 мг/ кг, эвтаназированной через 2 ч после реперфузии. Отмечается невыраженная вакуольная дистрофия эпителия канальцевого аппарата. Часть канальцев расширены с белковыми массами в просвете, но эпителий сохранен. Поражено менее 1/3 каналь­цев. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.100.

Рис. 6. Срез почки крысы, получавшей «Орозин» в дозе 700 мг/ кг, эвтаназированной через 24 ч после реперфузии. Отмеча­ется невыраженная вакуольная дистрофия эпителия каналь­цевого аппарата. Часть канальцев расширены с белковыми массами в просвете, но эпителий сохранен. Поражено менее 1/3 канальцев. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.100.

Рис. 7. Срез почки крысы, получавшей актовегин в дозе 80 мг/ кг, эвтаназированной через 2 ч после реперфузии. Значитель­ная часть эпителия канальцев с вакуольной дистрофией. Часть расширены с белковыми массами в просвете, эпителий дистрофичен и уплощен. Поражено 1/3-2/3 канальцев. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.100.

Рис. 8. Срез почки крысы, получавшей актовегин в дозе 80 мг/кг, эвтаназированной через 24 ч после реперфузии. От­мечается невыраженная вакуольная дистрофия эпителия канальцевого аппарата. Часть расширены с белковыми мас­сами в просвете, но эпителий сохранен. Поражено менее 1/3 канальцев. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.100.

Рис. 9. Возможные механизмы антиапоптогенного действия АГП. Звездочками выделены вероятные точки приложения АГП в ферментативных реакциях апоптоза (цит. по Г.А. Яровой и др., М., 2011, с модификацией).

 

Внутри группы частота выраженности микроско­пических изменений была схожа при эвтаназии через 2 и 24 ч после реперфузии.

Максимально выраженные изменения наблю­дались в контрольной группе животных, которые характеризовались значительной дистрофией эпителия и частичным некрозом канальцев. Ги­стологическое строение тканей почек крыс кон­трольной группы представлено на рис. 3, 4.

Наиболее эффективное цитопротекторное дей­ствие отмечено у тестируемого препарата «Орозин» во всех исследованных дозах. Гистологиче­ское строение тканей почек крыс данных экспери­ментальных групп представлено на рис. 5, 6.

Введение «Актовегина» оказало менее выра­женное цитопротекторное действие по сравнению с «Орозином». Гистологическое строение тканей почек крыс, получавших «Актовегин», представ­лено на рис. 7, 8.

ОБСУЖДЕНИЕ

При исследовании специфической активности препарата «Орозин» на модели ишемического по­ражения почки с последующей реперфузией было установлено, что он проявляет цитопротекторные свойства в широком терапевтическом диапазоне, вне зависимости от величины использованных доз. Полученные результаты свидетельствуют о восстановлении экскреторной функции почек в сравнении с группой контроля. В ответ на ишеми­ческое и последующее реперфузионное повреж­дение в последующем не наступал некроз тканей почек за счет оказанного цитопротекторного дей­ствия.

Одним из возможных механизмов цитопро- текторного действия АГП может быть их способ­ность быть донаторами и сохранять отрицатель­ный заряд мембран тромбоцитов, перицитов и клеток эндотелия сосудов, что в итоге приводит к снижению микротромбообразования [11]. Други­ми путями реализации антиагрегантного эффекта могут быть: ингибирующее влияние на протром- биназный комплекс, а также на комплекс GPIIb/ IIIa. Антиагрегантные свойства АГП могут реа­лизовываться обособленно, а также совместно с его потенциальным антиоксидантным действием. Для подтверждения данной гипотезы необходимо углубленное изучение антиоксидантных свойств АГП и лекарственных препаратов, разрабатывае­мых на его основе.

Известно, что апоптоз играет немаловажное значение при реперфузионном повреждения тка­ней. При этом нужно иметь в виду два обстоятель­ства: дефицит АТФ в очаге ишемии и развитие воспалительной реакции после реперфузии [14]. АГП, вероятно, играет важную роль при репер- фузионных повреждениях органов и тканей, эф­фективно подавляет ранний и отсроченный апоптоз, снижая активность каспазы-1 и каспазы-3 и блокируя интрануклеосомальный распад ДНК. Тем не менее, точный механизм данного дей­ствия остается неизвестным. Цитопротекторное действие в отношении TNF-α-индуцированного апоптоза может быть связано как с блокировани­ем клеточных TNF-α-рецепторов, так и прямым внутриклеточным действием на прокаспазу-8, 3-каспазу или стресс-активируемую протеинки- назу (JNK). Предполагаемые механизмы цитопро- текторного действия АГП за счет его влияния на активацию и взаимодействие ферментов апоптоза представлены на рис. 9.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, на модели экспериментально­го острого повреждения почек было установлено наличие цитопротекторных свойств препарата «Орозин». В качестве механизма действия АГП, за счет которого реализуется выявленный эффект на морфологические структуры почек, были пред­положены следующие гипотетические механиз­мы: влияние препарата на микроциркуляторное русло гломерулярного аппарата с улучшением реологических свойств крови и локального кро­вообращения, антиоксидантный механизм АГП, антиапоптогенное действие АГП на клеточные структуры в очагах ишемии.

Список литературы

1. Bellomo R et al. Acute renal failure–definition, outcome measures, animal models, fluid therapy and information technology needs: the Second International Consensus Conference of the Acute Dialysis Quality Initiative (ADQI) Group. Critical care 2004; Т. 8 (4); 204. doi: 10.1186/cc2872

2. Johnson RF, Gustin J. Acute renal failure requiring renal replacement therapy in the intensive care unit: impact on prognostic assessment for shared decision making. J Palliat Med 2011 Jul;14(7):883-889. doi: 10.1089/jpm.2010.0452

3. Ympa Y P et al. Has mortality from acute renal failure decreased? A systematic review of the literature. Am J med 2005; 118 (8); 827-832. doi: 10.1016/j.amjmed.2005.01.069

4. Dennen P, Douglas I S, Anderson R. Acute kidney injury in the intensive care unit: an update and primer for the intensivist. Critical care medicine 2010; 38(1); 261-275. doi: 10.1097/CCM.0b013e3181bfb0b5

5. Смирнов АВ, Добронравов ВА, Румянцев АШ и др. Национальные рекомендации. острое повреждение почек: основные принципы диагностики, профилактики и терапии. Часть I. Нефрология 2016; 20(1):79-104 [Smirnov AV, Dobronravov VA, Rumyantsev ASh et al. National guidelines acute kidney injury: basic principles of diagnosis, prevention and therapy. Part I. Nephrology (Saint-Petersburg). 2016; 20(1): 79-104 (In Russ.)]

6. Чукаева ИИ. и др. Уровни показателей острофазового ответа и окислительного стресса у больных острым инфарктом миокарда и их значение в течении заболевания. Вестник РГМУ 2007; (7): 18 [Chukaeva II i dr. Urovni pokazatelei` ostrofazovogo otveta i okislitel`nogo stressa u bol`ny`kh ostry`m infarktom miokarda i ikh znachenie v techenii zabolevaniia. VESTNIK RGMU 2007; (7): 18]

7. Вельков ВВ. С-реактивный белок-в лабораторной диагностике острых воспалений и в оценке рисков сосудистых патологий. Клинико-лабораторный консилиум 2008; 2(21): 37-48 [Vel`kov VV. S-reaktivny`i` belok-v laboratornoi` diagnostike ostry`kh vospalenii` i v ocenke riskov sosudisty`kh patologii`. Cliniko-laboratorny`i` konsilium. 2008; 2(21): 37-48]

8. Попков А. В. и др. Результаты стереометрического анализа состояния передней большеберцовой мышцы при дистракционном, последовательном дистракционнокомпрессионном остеосинтезе голени, в том числе с применением «Орозина» (экспериментально-морфологическое исследование). Гений ортопедии 2002; (2) [Popkov A. V. i dr. Rezul`taty` stereometricheskogo analiza sostoianiia perednei` bol`shebertcovoi` my`shtcy` pri distraktcionnom, posledovatel`nom distraktcionno-kompressionnom osteosinteze goleni, v tom chisle s primeneniem «Orozina» (e`ksperimental`no-morfologicheskoe issledovanie). Genii` ortopedii. 2002; (2)]

9. Huang Z, Ung T. Effect of alpha-1-acid glycoprotein binding on pharmacokinetics and pharmacodynamics. Curr Drug Metab 2013;14(2):226-238

10. Нордвик Б. Механизм действия и клиническое применение препарата актовегин. Актовегин. Новые аспекты клинического применения. M., 2002; 18-24 [Nordvik B. Mehanizm dei`stviia i clinicheskoe primenenie preparata aktovegin // Aktovegin. Novy`e aspekty` clinicheskogo primeneniia. M. 2002; 18-24]

11. Макаров ЕВ, Кривохижина ЛВ. Альфа-1-кислый гликопротеин, реактант острой фазы воспаления, как важный гомеостатический фактор организма: обзор литературы. Вестн Южно-Уральск гос университета. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. 2005; 4(44) [Makarov EV, Krivohizhina LV. Al`fa-1-kisly`i` glikoprotein, reaktant ostroi` fazy` vospaleniia, kak vazhny`i` gomeostaticheskii` faktor organizma: obzor literatury`. Vestneyk Iuzhno-Ural`skogo gosudarstvennogo universiteta. Seriia: Obrazovanie, zdravookhranenie, fizicheskaia kul`tura. 2005; 4(44)]

12. Rabb H et al. Antibodies to ICAM-1 protect kidneys in severe ischemic reperfusion injury. Biochemical and biophysical research communications 1995; 211(1):67-73. doi: 10.1006/bbrc.1995.1779

13. Chertow GM et al. Acute kidney injury, mortality, length of stay, and costs in hospitalized patients. Journal of the American Society of Nephrology 2005; 16(11):3365-3370. doi: 10.1681/ASN.2004090740

14. Голубев АМ и др. Апоптоз при критических состояниях. Общая реаниматология 2006;2(5-6):184-190 [Golubev AM i dr. Apoptoz pri kriticheskikh sostoianiiakh. Obshchaia reanimatologiia. 2006;2(5-6):184-190]


Об авторах

Г. В. Ванатиев
Санкт-Петербургский институт фармации
Россия

Ванатиев Гаджимагомед Витальевич - группа общей токсикологии, токсиколог.

188663, Ленинградская обл., Всеволожский р-н, п. Кузьмоловский, 245,+7(812) 603-24-33



П. В. Буренков
Санкт-Петербургский институт фармации
Россия

Буренков Павел Валерьевич - группа экспериментальной фармакологии №1, фармаколог.

188663, Ленинградская обл., Всеволожский р-н, п. Кузьмоловский, 245, +7 951-659-90-30



А. Г. Лютов
Иммуно-Гем
Россия

Лютов Андрей Германович - доктор биологических наук, профессор

125212, Москва, Головинское шоссе, д. 8, корп. 2А, +7(495) 232-61-74



М. А. Ковалева
Санкт-Петербургский институт фармации
Россия

Ковалева Мария Александровна - кандидат биологических наук, руководитель группы фармакодинамики.

188663, Ленинградская обл., Всеволожский р-н, п. Кузьмоловский, д. 245, +7(812) 603-24-33



М. Н. Макарова
Санкт-Петербургский институт фармации
Россия

Макарова Марина Николаевна - доктор медицинских наук, заместитель директора по науке.

188663, Ленинградская обл., Всеволожский р-н, п. Кузьмоловский, д. 245, +7(812) 603-24-33


В. Г. Макаров
Санкт-Петербургский институт фармации
Россия

Макаров Валерий Геннадьевич - доктор медицинских наук, профессор, генеральный директор.

188663, Ленинградская обл., Всеволожский р-н, п. Кузьмоловский, д. 245, +7 (812) 603-24-33



Для цитирования:


Ванатиев Г.В., Буренков П.В., Лютов А.Г., Ковалева М.А., Макарова М.Н., Макаров В.Г. ЦИТОПРОТЕКТОРНЫЙ ЭФФЕКТ АЛЬФА-1 КИСЛОГО ГЛИКОПРОТЕИНА НА МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО РЕПЕРФУЗИОННОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧКИ. Нефрология. 2018;22(1):91-97. https://doi.org/10.24884/1561-6274-2018-22-1-91-97

For citation:


Vanatiev V.G., Burenkov P.V., Lutov A.G., Kovaleva M.A., Makarova М.N., Makarov V.G. CYTOPROTECTIVE EFFECT OF ALPHA-1 ACID GLYCOPROTEIN ON THE EXPERIMENTAL MODEL OF RENAL REPERFUSION INJURY. Nephrology (Saint-Petersburg). 2018;22(1):91-97. (In Russ.) https://doi.org/10.24884/1561-6274-2018-22-1-91-97

Просмотров: 168


ISSN 1561-6274 (Print)
ISSN 2541-9439 (Online)