Нефропротекторные эффекты ацизола на фоне токсического действия сульфата кадмия

ВВЕДЕНИЕ

Антропогенное загрязнение  окружающей среды кадмием ведет к кумуляции в организме и стимулирует возникновение ряда патологиче­ских процессов. Патологические эффекты кадмия реализуются благодаря его влиянию на процессы окислительного фосфорилирования [1, 2], конку­рентное замещение цинка в ряде металлоэнзимов, участвующих в процессе клеточного дыхания, и изменение их активности [3], усиление активно­сти перекисного окисления липидов [4-6], а также нарушение обмена жизненно важных электроли­тов [7]. Перечисленные механизмы могут приво­дить к развитию тяжелых острых и хронических процессов, поражению практически всех органов и систем, включая почки [8-11].

В наших предыдущих экспериментах была вы­явлена способность кадмия вызывать уменьшение осмотической стойкости мембран эритроцитов и развитие выраженной анемии с прогрессивным снижением уровня гемоглобина [12], что может быть связано как с гемолизом эритроцитов, так и с влиянием кадмия на обмен меди и железа, не­посредственно участвующих в процессе кровет­ворения. Указанные изменения могут усиливать прооксидантное действие избытка кадмия, равно как и угнетение ферментов антиоксидантной за­щиты, что также отмечалось ранее в наших иссле­дованиях [12].

Препарат ацизол (металлокомплекс соли цинка с 1-винилимидазолом), являясь антигипоксантом, показал эффективность в снижении патологиче­ского влияния кадмия на гематологические прояв­ления и систему перекисного окисления липидов в условиях хронической кадмиевой интоксикации.

Целью данного исследования было изучение патогенетических механизмов нарушения функ­ции почек при длительном введении сульфата кадмия и анализ возможных профилактических эффектов ацизола.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В проведении экспериментов руководствова­лись статьёй 11-й Хельсинской декларации Все­мирной медицинской ассоциации (1964), «Меж­дународными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использо­ванием животных» (1985) и Правилами лабора­торной практики в Российской Федерации (при­каз МЗ РФ от 19.06.2003 г. № 267).

Работа проведена на 60 крысах-самцах линии Вистар массой 200-300 г, разделенных на три группы: 1-я - интактные крысы, 2-я - крысы с введением кадмия (Cd), 3-я - опытные крысы с введением с ацизола (Cd+Ац). Животным двух групп вводили подкожно раствор сульфата кадмия в дозе 0,1 мг/кг (в пересчете на металл) каждый день в течение двух месяцев. Животным опытной группы 3 одновременно с кадмием вводили рас­твор ацизола через зонд в желудок ежедневно в дозе 30 мг/кг, также в течение двух месяцев.

Через 1 мес и через 2 мес эксперимента иссле­довали у контрольных, опытных и интактных жи­вотных показатели выделительной функции по­чек при спонтанном шестичасовом диурезе. Для сбора мочи животные помещались в обменные клетки на 6 ч. После этого в условиях спонтанно­го диуреза определялись объём диуреза, скорость клубочковой фильтрации по клиренсу эндоген­ного креатинина, канальцевая реабсорбция воды. Концентрацию белка, креатинина в биологиче­ских жидкостях (моче и плазме крови) определя­ли с помощью спектрофотометра «Apel PD-303» (Япония), концентрацию натрия - методом пла­менной фотометрии («ФПА-2», Россия).

В конце эксперимента животных забивали с использованием тиопенталового наркоза, и в гомогенатах тканей почек послойно определяли концентрацию натрия и мочевины, а также актив­ность Na⁺/К⁺ -АТФазы по методу J.C. Scow (1957).

Для гистологических исследований образцы ткани почек фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего подвергали заливке в па­рафин с последующим приготовлением срезов толщиной 7-8 мкм. Срезы окрашивали гематокси­лином и эозином. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением 80*200*400.

Статистический анализ результатов исследо­вания проводили с использованием программы «GraphPad Prizm 6.1» (США). Данные приведены в форме средней арифметической величины (М) и ошибки средней (±m). Учитывая нормальное рас­пределение исследуемых показателей, применяли параметрические статистические методы. Для по­парного сравнения независимых групп использо­вался t-критерий Стьюдента, для выявления взаи­мосвязей рассчитывали коэффициент корреляции r Пирсона. Нулевую статистическую гипотезу об отсутствии различий и связей отвергали при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Подкожное введение сульфата кадмия через один месяц интоксикации (рис. 1) приводит к до­стоверному увеличению относительно интактных животных, спонтанного шестичасового диуреза за счет существенного снижения канальцевой ре­абсорбции (p<0,001). Через два месяца экспери­мента при мало меняющейся клубочковой филь­трации (p<0,1) диурез увеличивался (p<0,001) еще в большей степени за счет прогрессивного снижения канальцевой реабсорбции (p<0,001).

В группе животных с одновременным введе­нием ацизола (см. рис. 1) также отмечается уве­личение спонтанного диуреза (p<0,001) уже че­рез один месяц, что, однако, обусловлено значи­тельным увеличением клубочковой фильтрации (p<0,01) и меньшей степенью снижения канальце­вой реабсорбции [p<0,01; достоверное отличие от контроля (Cd) - р<0,001]. В конце второго месяца эксперимента увеличение спонтанного диуреза и снижение канальцевой реабсорбции стали более выраженными (р<0,001), повышение клубочковой фильтрации стало носить менее выраженный ха­рактер (р<0,05).

Уровень экскреции натрия достоверно уве­личился (рис. 2) при изолированном введении соли кадмия только в конце второго месяца экс­перимента (р<0,001), что было обусловлено сни­жением его канальцевой реабсорбции (р<0,001), несмотря на достоверное снижение фильтрацион­ного заряда катиона (р<0,05).

У животных с профилактическим введением ацизола (см. рис. 2) через один месяц эксперимен­та было отмечено увеличение экскреции натрия с мочой (р<0,01), за счет увеличения фильтраци­онного заряда (р<0,01), без снижения показателя относительной канальцевой реабсорбции, что от­личало эти изменения от таковых в группе с введением только кадмия. Через два месяца сочетан­ного введения соли кадмия и ацизола увеличение экскреции натрия относительно фона (р<0,001) было вызвано как увеличением фильтрационно­го заряда этих ионов (р<0,05), так и снижением канальцевой реабсорбции (р<0,05). Однако сни­жение уровня канальцевой реабсорбции ионов относительно фона носит менее выраженный ха­рактер, чем в группе с изолированным введением сульфата кадмия (р<0,05).

С целью изучения механизма нарушения воды и электролитов определяли концентрацию натрия и мочевины в гомогенатах почечной ткани по­слойно. Как представлено в табл. 1, у животных с введением сульфата кадмия концентрация на­трия во всех слоях почек была достоверно ниже таковой относительно интактных (кора: р<0,02; медулла и сосочек: р<0,001). Такое же достовер­ное снижение концентрации мочевины (табл. 2) отмечается в медуллярном и папиллярном слоях почек (медулла и сосочек: p<0,001) у животных с изолированным введением кадмия.

У группы животных с сочетанным введением ацизола и тяжелого металла содержание как на­трия, так и мочевины (см. табл. 1, 2) в слоях почек также достоверно было ниже значений у интактных животных, однако концентрации их в мозго­вом и сосочковом слоях были достоверно выше таковых у контрольных животных (медулла и со­сочек p<0,001).

Изменения функции почек имеют статисти­чески значимые корреляционные взаимосвязи с содержанием осмотически активных веществ в слоях ткани почек, по оси сравнения: интактные - контроль (Cd) - опыт (Cd+Ац). К примеру, снижение канальцевой реабсорбции воды у жи­вотных групп сравнения имеет положительную корреляционную взаимосвязь со снижением кон­центрации, натрия в корковом (r=0,94), мозговом (r=0,92, p<0,01) и сосочковом (r=0,91, p<0,01) сло­ях, а также мочевины в корковом (r=0,90 p<0,01), мозговом (r=0,97 p<0,01) и сосочковом (r=0,98, p<0,01) слоях. Таким образом, можно полагать, что увеличение объема диуреза является резуль­татом снижения канальцевой реабсорбции воды из-за уменьшения действия вазопрессина в условиях недостаточного осмотического градиента слоев почек.

Отмеченные изменения функционального со­стояния почек и изменения осмотического концен­трирования ткани почек не раскрывают в полной мере механизмов, приводящих к вышеописанным проявлениям. Учитывая тропность многих тяже­лых металлов, в частности кадмия, к нарушению дыхательных систем клеток и, следовательно, энергообразования, а также возможность прямо­го токсического воздействия кадмия на многие ферментные системы, нами была исследована ак­тивность фермента Na⁺/К⁺-АТФазы в слоях ткани почек. Активность Na⁺/К⁺-АТФазы у животных с хронической кадмиевой интоксикацией была снижена относительно таковой у интактных жи­вотных: в корковом слое - на 11,5% относитель­но интактных (с 2,6±0,11 до 2,3±0,15 мкмоль Рн/ мг белка/ч, р<0,05); в мозговом слое - на 27,4% (с 7,18±0,28 до 5,21±0,33 мкмоль Рн/мг белка/ч, р<0,001). На фоне профилактического введения ацизола уменьшение активности фермента было не столь выраженным. Так, уменьшение актив­ности Na⁺/К⁺-АТФазы в корковом слое произо­шло на 7,7% относительно интактных (с 2,6±0,11 до 2,4±0,08 мкмоль Рн/мг белка/ч, р<0,1), что на 4,1% меньше, чем у контрольных животных, а в медуллярном - на 11,6% (с 7,18±0,28 до 6,35±0,28 мкмоль Рн/мг белка/ч, р<0,01), что также отража­ет меньшую степень угнетения активности фер­мента на 17,9% относительно контроля с изолиро­ванным введением сульфата кадмия. Изменение активности Na⁺/К⁺-АТФазы в слоях ткани почек у животных групп сравнения коррелирует с при­веденными выше соответствующими значениями концентрации натрия как в корковом, так и мозго­вом веществе почек (r=0,99, р<0,01).

Повреждающее действие тяжелого металла подтверждается увеличением концентрации бел­ка в моче (рис. 3) уже через 1 мес изолированного введения соли кадмия (р<0,001), а через два ме­сяца прирост был почти в пять раз (р<0,001). В группе с сочетанным введением соли кадмия и ацизола достоверное увеличение концентрации белка в моче отмечалось только через два месяца эксперимента, выраженность чего была в значи­тельно меньшей степени (р<0,01), чем в контроль­ной группе.

Отмеченные нами как в этом, так и предыду­щих исследованиях, функциональные изменения в деятельности почек находят своё отражение в картине гистологических исследований ткани по­чек. Так, введение животным соли кадмия в дозе 0,1 мг/кг в течение 2 мес привело к значительным изменениям (рис. 4), представленным проявлени­ями дистрофии, некроза, дисциркуляторных про­цессов и воспалительной реакции. Превалируют патогистологические признаки повреждения ка­нальцев.

Структурные отличия между группами с изоли­рованным введением соли кадмия и сочетанным введением сульфата кадмия и ацизола заключа­ются в уменьшении степени выраженности про­явлений всех вышеуказанных патологических процессов (рис. 5). Также уменьшено количество клеток эпителия канальцев, в которых гидропическая дистрофия достигает перехода в тотальный колликвационный некроз. Количество каналь­цев с сохраненным просветом также значительно больше, чем в группе с изолированным введением сульфата кадмия.

ОБСУЖДЕНИЕ

Отмеченные под влиянием сульфата кадмия из­менения выделительной функции почек, проявив­шиеся в увеличении диуреза и экскреции натрия вследствие снижения канальцевой реабсорбции как воды, так и катиона натрия, могут быть обу­словлены рядом факторов. Одним из возможных механизмов, приводящих к нарушению процес­са реабсорбции в нефронах, можно считать пря­мое избирательное действие кадмия на эпителий проксимальных отделов канальцев. Снижение со­держания натрия и мочевины в слоях ткани почек, приводящее к падению осмотического градиента, наличие выраженных корреляционных связей между функциональными показателями деятель­ности почки и концентрацией осмотически ак­тивных молекул в слоях ткани почек, позволяет думать о сниженной эффективности вазопресси- нового механизма концентрирования мочи в связи с токсическим действием кадмия.

Нефропротекторная эффективность ацизола проявилась в основном в уменьшении выражен­ности дисфункции канальцевого аппарата нефронов. Увеличенный диурез у крыс опытной группы с введением кадмия и ацизола был обусловлен в большей степени приростом клубочковой филь­трации, чем снижением канальцевой реабсорб­ции. Такой прирост скорости клубочковой филь­трации может быть объяснен гемодинамическими эффектами ацизола [13]. Еще одним важным благоприятным эффектом ацизола можно считать снижение степени выраженности протеинурии при воздействии кадмия.

Протективное действие ацизола нашло свое отражение в гистологической картине ткани по­чек, где на фоне введения препарата отмечено снижение выраженности дистрофического и некробиотического действия кадмия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, применение ацизола, обладаю­щего антигипоксическими свойствами, снижает выраженность структурно-функциональных из­менений канальцевого аппарата почек.